应用体外扩增法对兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步研究自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.方法实验于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.①DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(molecular probes公司),FITC标记的凝结素BS-1(vector公司),鼠抗人CD34抗体(Biolegend公司),兔抗人Flk-1抗体(Biolegeng公司),鼠抗人CD133单抗(R&D公司).②选用新西兰大白兔8只,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞.接种密度为1×106/cm2,加入含有血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,观察细胞生长情况及增殖能力.③通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.④免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1 的表达.结果(①细胞形态观察新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增髓能力培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果在血管内皮祖细 胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;二者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组化及流式细胞仪检测结果细胞表面标志物CD133,Flk-1,CD34均呈阳性.结论体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。结果与结论：培养前4d细胞增殖不明显,第5～10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133＋细胞占19.2%,CD34＋细胞占28.7%,CD34＋/CD133＋细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞☆

背景:对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐.目的:探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性. 方法:采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况.同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力.设立骨髓单个核细胞培养法为对照. 结果与结论:全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义(P>0.05).说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便.     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

辛伐他汀对体外培养人脐静脉血内皮祖细胞扩增及黏附能力的影响

背景:他汀类药物可促进急性缺血后的血管新生、加速球囊损伤血管的再内皮化并减少新内膜下组织的增生,且这两个作用均与血管内皮祖细胞密切相关.目的:通过体外培养人脐静脉血血管内皮祖细胞,观察辛伐他汀对血管内皮祖细胞扩增及黏附能力的影响.设计、时间及地点:以细胞为观察对象,分组对比实验,于2006-02/10在吉林大学基础医学院病理生理教研室完成.材料:人脐静脉血采集来源于吉林大学第二临床医学院妇产科6名正常足月顺产健康产妇.方法:密度梯度离心法分离培养人脐静脉血血管内皮祖细胞.通过免疫荧光法观察内皮细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白和荆豆凝血素Ⅰ情况,流式细胞仪定量检测血管内皮祖细胞表面CD133、CD34和KDR抗原表达阳性率来鉴定血管内皮祖细胞.倒置显微镜下观察血管内皮祖细胞形态学变化,计数细胞并绘制生长曲线.实验按M199培养基含辛伐他汀纯品浓度不同分5组,分别为0, 0.01,0.1,1,10 μmol/L 辛伐他汀组,其中0 μmol/L作对照.四甲基偶氮唑盐比色法观察血管内皮祖细胞增殖情况,计数贴壁细胞数法评价血管内皮祖细胞的黏附程度.主要观察指标:原代培养血管内皮祖细胞形态变化;各组细胞增殖及黏附能力.结果:①培养细胞呈长梭形,接种2～4 d 梭形形态细胞较少,为细胞生长的潜伏期;6～10 d 贴壁梭形细胞逐渐增多,为对数增殖期;10～14 d 细胞融合呈集落样生长,梭形细胞明显增多,进入生长平台期.②激光共聚焦显微镜鉴定乙酰化低密度脂蛋白、荆豆凝血素Ⅰ双染阳性的细胞为正在分化的血管内皮祖细胞.③流式细胞仪检测细胞表达CD133、CD34和KDR抗原的阳性率分别为(7.30±2.71)%、(42.00±6.42)%,(89.30±10.45)%.④四甲基偶氮唑盐比色结果表明各浓度组血管内皮祖细胞增殖活力、贴壁的血管内皮祖细胞数均较对照组增强(P < 0.05);但以1 μmol/L 浓度下血管内皮祖细胞增殖活力最强.结论:辛伐他汀能增强体外培养血管内皮祖细胞的扩增及黏附能力.     

实验性牙移动大鼠外周血内皮祖细胞的培养

背景:观察血管内皮祖细胞在牙周血管改建中的作用规律对于研究正畸牙周改建机制具有重要意义.目的:对牙移动大鼠外周血内皮祖细胞进行体外分离、培养及鉴定,探讨牙齿移动足否可动员骨髓内皮祖细胞进入外周血.设计、时间及地点:细胞体外分离培养及生物学指标检测,随机对照动物实验.于2007-09/2008-04在吉林省口腔生物医学工程重点实验室完成.材料:24只Wistar大鼠.随机分为实验组和对照组,每组12只.方法:实验组建立大鼠牙移动模型,对照组置牵拉装置但不加力.加力第2天取两组动物外周血制作细胞涂片,检测其中CD133阳性细胞数.同时以Percoll密度梯度分离提取其外周血单个核细胞,培养全第12天,取两组细胞爬片进行相关指标检测.主要观察指标:以免疫细胞化学染色和免疫荧光化学染色检测细胞表面标志物,荧光化学检测细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素1情况,MTT法检测细胞增殖情况.结果:实验组细胞涂片中CD133阳性细胞率明显高于对照组(P＜0.05).所培养细胞可同时吸收Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白、FITC标记的荆豆凝集素1,呈CD133、Ⅷ因子、CD34阳性.实验组细胞增殖活性高于对照组(P＜0.05).结论:实验初步证实了实验性牙移动可动员大鼠骨髓内皮祖细胞进入外周血.     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定

背景:当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞.目的:通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础.方法:绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分了CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-Lectin和Dil标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能.结果与结论:绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3～5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%:免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达.细胞能同时吞噬FITC-labeledBS-1-lectin,Dil-ac-LDL阳性率达85.3%.证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞.     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植实验

背景:目前,小径人工血管移植后由于缺乏内皮细胞衬里和抗血栓特性,长期通畅率低。有研究尝试用成熟内皮细胞种植人工血管以增强其抗血栓能力,以提高长期通畅率,但由于种子细胞和支架材料存在的缺陷,其效果并不令人满意。因此,临床上亟需寻找合适的种子细胞及血管支架材料,改善小径人工血管移植长期通畅率低这一现状。目的:探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞的可行性,并种植聚氨酯小径人工血管表面,为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞。设计:观察性实验。单位:中山大学附属第一医院心血管医学部,免疫学教研室。材料:实验于2004-09/2005-05在中山大学附属第一医院完成。健康志愿者成人骨髓(n=7)约10mL。方法:收集健康成人骨髓单个核细胞,置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中,用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加以诱导,通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞。将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,用扫描电镜观察。主要观察指标:①细胞形态学变化。②免疫组化VWF和CD34抗体染色结果。③聚氨酯小径人工血管表面内皮祖细胞的黏附生长状态。结果:①在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等诱导因子存在的条件下,骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞,单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列。②免疫组化示VWF和CD34抗体染色阳性。②扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构,孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行。种植细胞后,聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长,有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内。结论:在体外能将骨髓单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,而诱导分化的内皮祖细胞在小径聚氨酯人工血管上黏附生长状态良好,提示体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞。     

兔骨髓源单个核细胞诱导血管内皮祖细胞修复尿道缺损

背景：如何解决尿道替代修复材料来源和改善新尿道的血液供应已成为尿道修复与重建研究的瓶颈问题。目的：观察血管内皮祖细胞对尿道缺损修复后改善新尿道组织血液循环的效果。设计、时间及地点：组织工程体内实验，于2006-01／2008-02在郑州大学第一附属医院外总实验室完成。材料：3～5月龄雄性日本大耳白兔13只，1只用于制备骨髓源单个核细胞，剩余12只随机分为细胞修复组8只，模型组4只。方法：无菌抽取兔两侧髂前上嵴骨髓，Percoll法贴壁分离培养单个核细胞，加入含VEGF、bFGF的培养基进行体外诱导分化，待细胞长满培养瓶底后胰蛋白酶消化传代。两组兔均建立尿道缺损模型，将脱细胞处理的无菌新鲜人羊膜修剪成1cm^2置于尿道缺损处，用0／6DG线将其两端分别与尿道残端连续缝合，形成尿道。细胞修复组将传至第3代的兔骨髓源单个核细胞浓度调整至10^10L^-1，注射于新尿道两端的吻合口处，每处0．1mL，0／6DG线间断缝合皮下组织覆盖成形后的尿道，并在近吻合口处和新修复尿道之中间处注射细胞悬液，每处0．5mL；模型组在同样位点注射等量的空白细胞培养液。移植后4，12周制作尿道组织石蜡切片。主要观察指标：细胞形态及鉴定结果，修复后尿道组织的血管再生情况。结果：兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长，4d后生长加速，呈克隆样生长；第10天出现典型的铺路石样改变，并迅速表现出条索状、草束状生长形式；所培养的细胞表型由CD34^＋／CD133^＋／CD31^＋逐渐转变成CD34^＋／CD133^-／CD31^＋。与模型组比较，移植后第4，12周细胞修复组尿道组织内毛细血管再生数量均明显多于模型组（t=-9．034～5．985，P〈0．01）。结论：兔骨髓源单个核细胞可在体外诱导分化为血管内皮祖细胞，且血管内皮祖细胞对改善尿道缺损修复后局部血液循环的效果非常明显。     

Endothelial colony forming units: are they a reliable marker of endothelial progenitor cell numbers?

BACKGROUND. Flow cytometry and cell culture, the two main laboratory techniques employed for counting endothelial progenitor cells (EPCs), have serious limitations. Mononuclear cells cultured in media favouring endothelial growth allow cells to replicate and differentiate/mature. EPCs under these circumstances tend to form groups of cells called endothelial colony forming units (EC-CFUs). EC-CFUs are widely accepted as a surrogate as an estimate of EPC number and function in cell culture. However, some important limitations may restrict the assumption that EC-CFUs reflect EPC numbers accurately. OUR FINDINGS. Our own experience of EPC culture in atrial fibrillation has demonstrated that: 1) the size of EC-CFUs and proportion of single cells fluctuate significantly, even on the same culture plate; 2) the ability of EPCs to migrate towards one another to form EC-CFUs varies; and 3) the rate of EPC differentiation and proliferation may significantly affect the number of EC-CFUs, despite similarities in EPC counts on separate plates. In contrast, the count of differentiated cultured EPCs by flow cytometry with specific mature endothelial markers (e.g. CD146, vascular endothelial (VE) cadherin) is a potentially more objective alternative. SUMMARY. Endothelial CFU counts represent the cumulative characteristics of EPC quantity and their functional characteristics, and cannot be reliably used for the estimation of EPC numbers in peripheral blood or the bone marrow. Until stronger definition(s) of bone marrow or peripheral blood population(s) of EPCs are developed, flow cytometry may be the more optimal technique for EPC quantification.     

人循环血管内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)的分离、培养、分化及鉴定方法,探索EPCs体外扩增所需的条件。方法采集健康成人外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞(MNC),接种在纤维连接蛋白包被的培养板上,在加有EGM-2-MV-SingleQuots的培养液中培养和扩增。于培养第7天选择免疫荧光(Dil-acLDL/FITC-UEA-1)鉴定培养所得的细胞是否具有EPCs的特征。结果MNC在培养的第2天开始出现成簇现象,第4天细胞由圆形转变为梭形贴壁细胞,呈条索状或管状分布;激光共聚焦显微镜显示双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs。结论人外周血MNC在体外经适当条件的培养,完全可以分化成EPCs。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

小鼠异基因骨髓移植γ线清髓性照射对骨髓内皮龛的损伤研究

本研究探索异基因骨髓移植清髓性γ线照射预处理对受鼠骨髓内皮的损伤程度。体外培养小鼠骨髓单个核细胞,经5-7天检测其表面标记、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1鉴定,并行CFSE标记。分析正常组、清髓性照射组、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）移植组及照射联合EPC移植组小鼠外周血中白细胞变化、骨髓内皮的改变及CFSE标记EPC的骨髓内分布。结果发现,培养细胞鉴定证实为CD31＋CD133＋CD45low/-,且具有吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1能力。小鼠清髓照射后外周血白细胞迅速减少,与正常组相比,有显著差异（p〈0.05）。照射后3天,骨髓中大量出血,内皮细胞和基底膜间连接被损坏。清髓照射后输注CFSE标记EPC,18小时后小鼠骨髓中可见CFSE＋细胞,其细胞量是正常小鼠单纯EPC输注组的58倍（p〈0.05）。结论：移植清髓照射预处理引起严重骨髓内皮龛损伤,该损伤驱动外源性EPC的归巢。     

Thrombin and PAR-1 stimulate differentiation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells

Endothelial progenitor cells (EPCs) from the bone marrow play an important role in vascular response to injury and ischemia. The mediators involved in the mobilization, recruitment, proliferation and differentiation of EPCs are not fully understood. In this study, the role of coagulation factor thrombin and protease-activated receptor-1 (PAR-1) on bone marrow-derived cell proliferation and differentiation was investigated. Bone marrow cells (BMCs) were isolated from C57/BL6 mice and plated on fibronectin-coated flasks. Cell characteristics, proliferation and the expression of endothelial cell markers were determined using immunohistochemistry, thymidine uptake and fluorescence activated-cell sorting (FACS), respectively. The results show that thrombin stimulated enrichment of bone marrow cells with endothelial morphology, exhibiting acetylated-low-density lipoprotein (LDL) uptake and isolectin staining. Thrombin or PAR-1-activating peptide produced a 2- to 3-fold increase in the total number of cells as well as an increase in vascular endothelial (VE)-cadherin-positive cells. Thrombin treatment of VE-cadherin-negative cells prepared after cell sorting resulted in the generation of 3- to 4-fold higher VE-cadherin-positive cells than the untreated cultures. Increase in VE-cadherin-positive cells was inhibited by hirudin and efegatran. These results provide first evidence for a novel activity of thrombin and PAR-1 on bone marrow progenitor cell proliferation and EPC differentiation, and suggest their potential role in vascular regeneration and recanalization of thrombus.