人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的：将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1（XBP1u）的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法：重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l（DE3）,在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2＋-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果：XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论：成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

nm23-M2 cDNA克隆、表达及抗体制备

为通过基因工程技术表达和纯化重组nm23-M2蛋白，进而制备高效价、高特异性的抗血清。构建在大肠杆菌中高效表达pQE30／nm23-M2表达质粒，Ni^＋-NTA亲和层析纯化；用纯化蛋白免疫兔，制备抗血清并纯化，琼脂双向扩散法测效价，免疫组织化学比较它与抗NM23-H2抗体的特异性。结果：nm23-M2 cDNA序列完全正确，表达的17KD可溶性融合蛋白占菌体总蛋白45％，纯化后纯度97％以上，抗血清效价为1：64—128，提纯后纯度在90％以上，特异性高于NM23-H2抗体。     

抗人α-synuclein多克隆抗体的制备和鉴定

制备特异性抗人α synuclein抗血清 ,用于α synuclein相关退行性疾病及病理状态的研究。用重组人α synuclein免疫BALB/C小鼠 ,Dotblot、Westernblot及免疫组化法鉴定所获抗血清。Dotblot显示该抗血清可识别高于5 0ng的重组α synuclein。Westernblot分析表明此抗血清可识别人及大鼠脑匀浆中相对分子质量为 1 .8万的蛋白质 ,与以往报道α synuclein的相对分子质量一致。免疫组化染色显示α synuclein免疫活性物质广泛分布于皮质、海马、纹状体、杏仁核和嗅球 ,主要集中于神经元核周胞质及神经末梢。提示 :所制备的抗血清可特异性识别人及大鼠脑中的α synuclein ,该抗体对α synuclein相关疾病的研究具有应用价值     

巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析

目的 在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白（nestin）．制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性．探索神经发育及再生规律。方法 采用RT—PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后．将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Westem blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。Westemblotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果 成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。胛G诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25000的His融合蛋白并被Ni．NTA成功纯化．Westem blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后．经Westem blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestin蛋白。结论 获得了重组人nestin蛋白．制备的抗血清不仅可识别重组nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人RBBP10多克隆抗体并进行鉴定.方法 用人工合成的RBBP10蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性.结果此次获得的抗血清ELISA方法检测抗体效价达到1:16000,检测RBBP10的灵敏度最低为10μg/μ1.Western blot检测表明抗体效价高,特异性强.结论 应用该方法成功制备了人RBBP10多克隆抗体,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.     

hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLAl的表达检测

目的 制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达.方法 采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清.进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达.结果 制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤问质.肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则早广泛表达.结论 EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用.     

hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLA1的表达检测

目的 制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达.方法 采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清.进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达.结果 制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤问质.肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则早广泛表达.结论 EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用.     

妇产科概论 免疫学

061067nm23-M2cDNA克隆、表达及抗体制备/李茂萍…∥生殖与避孕.—2006,26(2).—67～71,120为通过基因工程技术表达和纯化重组nm23-M2蛋白,进而制备高效价、高特异性的抗血清。构建在大肠杆菌中高效表达pQE30/nm23-M2表达质粒,Ni+-NTA亲和层析纯化;用纯化蛋白免疫兔,制备抗血清并纯化,琼脂双向扩散法测效价,免疫组织化学比较它与抗NM23-H2抗体的特异性。结果:nm23-M2cDNA序列完全正确,表达的17KD可溶性融合蛋白占菌体总蛋白45%,纯化后纯度97%以上,抗血清效价为1∶64～128,提纯后纯度在90%以上,特异性高于NM23-H2抗体。结论:成功构…     

重组大鼠α突触核蛋白的制备与鉴定

目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。     

基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致。基因重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中。纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000。结论人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备。     

AD7C-NTP在老年痴呆患者及不同种属动物脑内的存在和意义

目的研究Alzheimer相关的神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein,AD7C-NTP)在老年痴呆(Alzheimer’s disease,AD)患者脑内、猪脑和小鼠脑内的表达,初步确定一种AD7C-NTP蛋白含量丰富的组织来源。方法采用免疫组织化学染色方法观察猪脑、小鼠脑内AD7C-NTP的分布,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)的方法检测AD患者脑内、猪脑、小鼠脑内AD7C-NTP的表达水平。结果免疫组化结果显示,猪大脑皮质、小鼠海马内有AD7C-NTP免疫反应阳性神经元分布;Western blot的结果显示,以AD7C-NTP C端抗体作为检测抗体时,AD患者脑和猪脑内可见相对分子质量为41000bp的免疫反应阳性条带,小鼠脑内未见免疫反应阳性条带。结论AD患者脑内、猪脑内存在AD7C-NTP,可作为提取AD7C-NTP蛋白纯品的来源之一,为研制AD7C-NTP诊断试剂盒提供实验材料。     

稳定表达野生型PINK1蛋白SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(AREP)PINK1基因真核表达载体,建立稳定表达PINK1蛋白的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增PINK1基因全长cDNA编码区序列,重组DNA技术定向插入真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)B,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,挑选出稳定转染的单克隆株,经提取gDNA进行PCR扩增、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表达。结果成功构建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表达载体,稳定转染SH-SY5Y细胞后,经提取gDNA扩增、RT-PCR及Westernblot检测到了野生型PINK1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达。结论构建了PINK1基因真核表达载体和稳定表达PINK1蛋白的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究PINK1基因功能及AREP发病机制提供了一个转基因细胞模型。     

重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的构建人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance,hHSS)体外表达体系。方法hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pT7-7载体,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因。再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21(DE3)中表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白。结果表达产物在15 000处有一明显条带,蛋白质肽指纹图谱分析与预期结果相符,经Western blot杂交印证,该15 000蛋白质为hHSS。结论通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS。     

Effect of cigarette smoke extraction on the expression of found in inflammatory zone 1 in rat lung epithelial L2 cells

Background Found in inflammatory zone 1 （FIZZ1） protein increased in pulmonary epithelial cells and in limited amounts of other lung cells.FIZZ1 increased in murine model of smoke induced chronic obstructive pulmonary disease.However,the direct role of FIZZ1 produced by pulmonary epithelium stimulated with cigarette smoke extraction has not been determined.We examined the expression and function of FIZZ1 in rat lung epithelial L2 cells.Methods The rat lung epithelial L2 cells （CCL 149） were exposed to cigarette smoke extraction,expression of FIZZ1 mRNA was investigated by RT-PCR.Levels of FIZZ1 protein were detected by Western blotting and laser confocal microscope.CCL 149 cells were treated with different concentrations and for different time of recombinant protein FIZZ1.After treatment,the expression levels of interleukin 8 （IL-8） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Results When CCL 149 cells were exposed to cigarette smoke extraction,FIZZ1 mRNA and protein levels expressed significantly higher than control group.Recombinant protein FIZZ1 promoted the expression of IL-8 in a dose and time dependent manner in a certain range.Conclusions Cigarette smoke extraction activates FIZZ1 at mRNA and protein levels in CCL 149 cells.Recombinant protein FIZZ1 induces the expression of IL-8 and may thus participate in the process of chronic obstructive pulmonary disease airway inflammation and airflow obstruction.Generally,immune cells such as macrophages,neutrophils and lymphocytes are unavoidably involved in airway inflammatory and immune responses to cigarette smoke,but it is still unclear whether their involvement in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease is based on the specific expression in lung epithelial cells of FIZZ1.     

甲/戊型肝炎重组抗原的表达、纯化及与传统甲肝疫苗免疫原性的比较

目的比较基因工程重组抗原与传统疫苗的免疫原性;探讨同一载体表达不同抗原的能力和抗原间的相互作用。方法将编码甲型肝炎病毒Vp1aa24-171和戊型肝炎病毒ORF2aa431-615的重组表达质粒pBV220-EAAg342及pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL-21,筛选出高效表达的菌种进行目的蛋白的表达。用DEAE-sepharose FF和CM-sepharoseFF离子层析交换柱纯化表达重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting方法进行分析鉴定。用纯化的重组蛋白及传统甲肝疫苗灭活疫苗与减毒活疫苗免疫小鼠,比较特异性抗体的产生水平。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为36000,表达量约占菌体总量的25%;且重组嵌合抗原EAAg342可以形成直径10～20nm的类病毒(virus-like particles,VLP)颗粒。Western blotting证实2种重组蛋白均能分别与甲型肝炎和戊型肝炎患者阳性血清发生特异性反应。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的抗戊肝特异性抗体;而抗甲肝特异性抗体水平与传统甲肝疫苗相比较低。结论使用原核系统表达的甲/戊肝重组抗原能够高效表达,2种不同的融合蛋白均分别具有良好的抗原性和免疫原性,具有开发双价疫苗及同时诊断甲型戊型肝炎试剂盒的前景。     

Enhanced expression of proneurotrophins in elevated introcular pressure-induced rat retinal ischemia

Background  Proneurotrophins such as the precursor of nerve growth factor (proNGF) and the precursor of brain-derived neurotrophic factor (proBDNF) interacted with sortilin and p75^NTR to form a complex capable of activating an apoptotic signaling. We found that the expression of p75^NTR and sortilin was increased in ischemic retina induced by elevated intraocular pressure (IOP), but the protein expression changes of proNGF and proBDNF in the same situation were not clear. This study aimed to ascertain the protein expression changes of proNGF and proBDNF in ischemic retina induced by elevated IOP.

Methods  Expression of proBDNF and proNGF was examined by double-labeling immunochemistry in normal rat retina, examined using Western blotting and analyzed using statistical methods in ischemic retina induced by elevated IOP.

Results  Immunocytochemistry showed that the proBDNF expressed in the ganglion cell layer (GCL) while the proNGF primarily existsed in both the nerve fiber layers (NFL) and large ganglion cell bodies of normal rat retina. Western blotting analysis demonstrated that the molecule weights of 28 kD (proBDNF) / 25 kD (proNGF) band were increased significantly (P <0.05) at days 3, 5 and 7 after retinal elevated-IOP-induced ischemia.

Conclusion  ProBDNF expressed in the GCL and proNGF primarily presented in NFL and large ganglion cell bodies of normal rat retina, the protein expression forms of 28 kD proBDNF and 25 kD proNGF increased in ischemic retina induced by elevated IOP.

     

建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

目的：对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法：用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组蛋白,经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果：原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度>95%;Azocasein法检测,0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论：成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性。