hESCs与A549细胞共培养后上清液在体外抗肺癌细胞的作用研究

目的：研究人胚胎干细胞H9与肺癌细胞A549共培养上清液对A549细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法：建立人胚胎干细胞H9与肺癌A549细胞直接接触式共培养体系,收集共培养上清液,将共培养上清液作用于肺癌A549细胞。以单独培养的A549细胞上清液为空白对照组,单独培养的人胚胎干细胞H9上清为对照组。显微镜下观察共培养上清液对肿瘤细胞生物行为学的影响;用CCK-8检测共培养上清液对肿瘤细胞增殖能力的影响;Hoechst染色法检测共培养上清液对肿瘤细胞的凋亡影响;细胞划痕实验检测共培养上清液对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响。结果：显微镜下观察到实验组肿瘤细胞数量逐渐减少甚至凋亡;CCK-8检测到实验组肿瘤细胞的增殖受到显著抑制（P<0.05）;Hoechst染色发现实验组细胞核出现典型凋亡形态;细胞划痕实验结果显示实验组肿瘤细胞的划痕愈合率明显低于空白对照组和对照组（P<0.05）。结论：人胚胎干细胞H9与肺癌A549细胞共培养上清液,在体外可以抑制肺癌A549细胞增殖、迁移,促进肿瘤细胞凋亡,具有一定的抗癌效应。     

3种人类间充质干细胞体外增殖能力和成脂能力的比较

目的: 从人足月胎儿的脐带组织和胎盘组织中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,观察人脐带组织MSCs（UC-MSCs）、胎盘组织MSCs（PL-MSCs）和胚胎组织MSCs（FT-MSCs）体外增殖能力和成脂分化潜能,为干细胞进一步应用于临床提供实验依据。方法: 无菌条件下获取人足月胎儿脐带组织和胎盘组织,通过Ⅰ型胶原酶酶解法分离出UC-MSCs和PL-MSCs,FT-MSCs由中科生物工程有限公司提供,取第3或4代MSCs进行检测。倒置显微镜观察细胞形态;活细胞计数法检测细胞增殖能力;流式细胞术测定UC-MSCs、PL-MSCs和FT-MSCs细胞周期并鉴定细胞表面标志物的表达阳性率。取3种组织来源的第3代MSCs进行成脂诱导,诱导18 d进行油红O染色,观察并比较3种不同组织来源MSCs的成脂能力。结果：从3种不同组织中均可获取梭形贴壁的MSCs,表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105均呈阳性表达,CD14、CD34和CD45均为阴性表达;FT-MSCs增殖能力明显强于UC-MSCs和PL-MSCs（P<0.01）,FT-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs的增殖指数（PI）分别为(36.66±1.30)%、(18.23±1.10)%和(10.03±1.20)%,3种MSCs的PI比较差异均有统计学意义(P<0.01)。3种MSCs经过成脂诱导液诱导后,油红O染色结果均为阳性,但是UC-MSC s体外成脂能力(油红O染色阳性率)明显强于FT-MSCs和PL-MSCs(P<0.01)。结论：3种不同组织来源MSCs在形态和细胞表面标记物等方面相似,FT-MSCs具有更强的增殖能力和增殖活性,UC-MSCs具有更强的体外成脂潜能。     

脐带间充质干细胞对脐血CD_(34)~+祖细胞免疫反应的影响

目的 探讨脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)是否能有效抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌.方法 从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测表面标志;将不同数量的UC-MSCs加入脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系中作为实验组,不加UC-MSCs的CD_(34)~+祖细胞、PBMC共培养体系为阴性对照;另设用Tramwell将UC-MSCs和脐血CD_(34)~+祖细胞、外周血单个核细胞共培养体系分隔培养,分别收集各组上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平.结果 UC-MSCs高表达CD_(105)、CD_(90)、CD_(29)、CD_(49);不表达CD_(40)、CD_(80)、CD_(86)、HLA-DR;加UC-MSCs组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(19.30±0.78) vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(50.28±1.29)、vs(31.68±3.08),(P＜0.05).而且具有数量依赖性;Transwell分隔培养组与阴性对照组相比,IFN-γ的分泌量减少(18.33±0.475)vs(27.00±1.11),(P＜0.05);IL-10的分泌量增多(48.47±1.18)vs(31.68±3.085,(P＜0.05);与接触培养组相比,IFN-γ的分泌量增多(18.33±0.47)vs(7.14±0.13),(P＜0.05),IL-10的分泌量减少(85.19±2.36)vs(48.47±1.18),(P＜0.05).结论 UC-MSCs能抑制脐血CD_(34)~+祖细胞的免疫反应中IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,并且这种作用部分依赖于细胞间的相互接触.UC-MSCs和CD_(34)~+祖细胞共移植可作为干细胞移植治疗缺血性心肌病的有效方式.     

不同种属来源真皮间充质干细胞对人皮肤成纤维细胞组织修复作用的影响

目的：比较小鼠真皮间充质干细胞（mdMSCs）和人胚胎真皮间充质干细胞（hdMSCs）对人皮肤成纤维细胞（hsFb）组织修复作用的影响,探讨异种属真皮间充质干细胞（MSCs）促进hsFb组织修复的可靠性．方法：采用低血清培养基,以消化-贴壁-传代法体外培养、鉴定mdMSCs和hdM—SCs,并与体外分离培养的bsFb于transwell培养体系中共培养,采用样本碱水解法和ELISA法分别检测第1,4日培养上清液中羟脯氨酸（Hyp）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的变化．结果：不同种属MSCs（mdMSCs／hdMSCs）对共培养上清液Hyp含量的影响差异（F=0．174）以及不同处理组（即不同细胞密度MSCs）培养上清液Hyp含量差异（F=1．304）均无显著性．不同时间（即第1和第4日）共培养上清液Hyp含量差异具有统计学意义（F=8．712,P〈0．01）．不同种属MSCs（mdMSCs／hdMSCs）对上清液TGF—β1的含量影响差异（F=0．062）以及不同处理组（即不同细胞密度MSCs）培养上清液TGF-β1含量差异（F=1．991）均无显著性．不同时间（即第1和第4日）培养上清液TGF-β1含量差异具有统计学意义（F=0．699,P〈0．05）．结论：不同来源真皮MSCs与hsFb共培养对胶原分泌和TGF-β1表达无影响,组织修复过程中,异种属真皮MSCs的诱导是可靠的．     

半乳糖凝集素1在脐带来源间充质干细胞调控类风湿关节炎患者T细胞功能中的作用

目的：明确半乳糖凝集素1（galectin-1）在脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs）调控类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）患者T细胞功能中的作用。方法： 应用慢病毒构建galectin-1低表达的UC-MSCs,即UC-MSCs(Gal-1-),采用直接接触培养方式分别将UC-MSCs、UC-MSCs(Gal-1-)与RA患者的CD4+ T细胞共培养。设立阴性对照组（CD4+ T）、阳性对照组［CD4+ T培养过程中加入植物血凝素（phytohae-magg lutinin,PHA）2 mg/L］、UC-MSCs-CD4+ T共培养组、UC-MSCs(对照shRNA)-CD4+ T共培养组及UC-MSCs(Gal-1-)-CD4+ T共培养组。MTS法检测CD4+ T细胞增殖,ELISA方法检测共培养上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factors α, TNF-α）水平,流式细胞术检测Th1/Th2/Th17细胞亚型。结果： UC-MSCs和UC-MSCs(对照shRNA)与CD4+ T细胞共培养组可显著抑制PHA诱导的CD4+ T细胞增殖及TNF-α表达,而UC-MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用。与阴性对照组（8.51%±2.04%）相比,UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可显著抑制Th1细胞分化（分别为4.83%±1.37%和5.13%±0.87%,P值分别为0.012和0.018）,而UC MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用（6.41%±0.96%,P=0.101）。与阴性对照组相比,UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可上调Th2并下调Th17比例,但差异并无统计学意义,UC-MSCs(Gal-1-)组的这一作用不明显。结论： UC-MSCs可抑制RA患者CD4+ T细胞的增殖、活化并可降低Th1细胞比例,但敲低galectin-1分子的表达后该作用减弱,提示galectin-1参与了UC-MSCs抑制RA患者CD4+ T细胞功能的过程。     

缺氧脐带间充质干细胞对脐血CD34＋祖细胞免疫反应的影响

目的：探讨脐带来源的缺氧间充质干细胞（MSCs）是否能有效抑制脐血CD34＋祖细胞免疫排斥反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌。方法：从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测其表面标志;将缺氧处理后的脐带MSCs加到脐血CD34＋祖细胞、外周血单个核细胞（PBMc）共培养体系中,96h后收集上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结栗：脐带MSCs不表达CD40、CD80、CD86、HLA—DR、CD34;缺氧的脐带MSCs能抑制共培养体系中淋巴细胞IFN-γ的分泌（与对照组比,P〈0．05）,同时促进IL-10分泌（与对照组比,P〈0．05）,但与非缺氧脐带MSCs组相比,IFN-γ的分泌量增多,IL-10的分泌量减少。结论：缺氧脐带MSCs能抑制脐血CD34＋祖细胞的免疫排斥反应,抑制IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,但与非缺氧脐带MSCs相比,免疫调节功能下调。     

体外合成CXCR4 mRNA对人脐带间充质干细胞迁移的影响

目的:探讨体外合成的趋化因子受体4(CXCR4)mRNA对人脐带血间充质干细胞迁移的影响。方法:构建合成CXCR4 mRNA的质粒,通过PCR和测序鉴定。体外合成CXCR4 mRNA转染人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)免疫荧光检测CXCR4蛋白的表达。Transwell检测转染CXCR4 mRNA的h UC-MSCs向SDF-1迁移的能力。结果:成功构建了CXCR4 mRNA载体,免疫荧光证实体外合成的CXCR4 mRNA可高效转染h UC-MSCs并增加其向SDF-1迁移的能力。结论:CXCR4 mRNA可高效转染h UC-MSCs并增强其向SDF-1迁移的能力,为h UC-MSCs靶向治疗的临床运用奠定基础。     

大鼠小胶质细胞及巨噬细胞对胶质瘤C6细胞株迁移能力的影响

目的 探讨大鼠小胶质细胞及外周血巨噬细胞对胶质瘤C6细胞株迁移能力的影响.方法 将大鼠小胶质细胞及外周血单核细胞诱导分化形成的巨噬细胞分别与胶质瘤C6细胞共培养,以大鼠成纤维细胞共培养为阳性对照,单纯胶质瘤C6细胞为空白对照,共培养0、24、48 h分别行划痕实验,于划痕后6 h观察划痕实验结果;共培养24、48 h时以CD11b标记、流式分选分离小胶质/巨噬细胞及C6细胞,行Western blot检测0、24、48 h小胶质/巨噬细胞IL-10、IL-18和MMP-9及C6细胞株TGF-β、FAS配体表达水平的改变.结果 早期小胶质细胞及巨噬细胞均抑制胶质瘤的迁移,巨噬细胞的抑制效果更强(P<0.05);与胶质瘤细胞共培养后两种细胞对肿瘤的抑制作用消失且差异无统计学意义,均表现为促进肿瘤迁移.小胶质细胞、巨噬细胞在初始阶段IL-10、IL-18、金属基质蛋白酶MMP-9表达略有不同,但共培养后两种细胞的上述蛋白表达均升高且一致;共培养后的胶质瘤细胞的TGF-β、FAS配体较共培养前表达均升高且一致.结论 小胶质细胞及巨噬细胞与C6胶质瘤细胞共培养后被驯化成同样的GAMs,对C6细胞迁移影响的生物学表现一致.     

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的 研究由脐带华通胶组织(Wharton's jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,以下简称UC MSCs)的方法,并进行UC- MSCs的各项鉴定.方法 脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到UC-MSCs,用流式细胞仪分析其表型特征,向成骨、成脂以及成神经元细胞诱导分化并鉴定.结果 由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞.原代细胞培养24～48 h内细胞开始贴壁生长,5～7 d左右可以传代培养,在2～3周时间内可以迅速扩增至107到108数量级.各项分化鉴定试验证实UC-MSCs具有多向分化潜能,能分化成骨、成脂细胞以及神经元细胞.UC-MSCs在体外培养传至20～30代仍保持稳定的细胞表面标记.结论 由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种UC-MSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞.     

细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)直接接触共培养诱导MSCs向血管内皮细胞分化的作用.方法 将MSCs和HUVECs按一定比例混合直接共培养,48 h后用ELISA检测其共培养细胞培养液(实验组)及MSCs与HUVECs各自单独培养48 h后再混合的培养液(对照组)中VEGF含量;5 d后用免疫荧光细胞化学法观察和分析诱导后MSCs的胎肝激酶-1 ( fetal liver kinase-1, Flk-1) 和血管性血友病因子( von Willebrand factor, vWF)的表达以及其Dil-ac-LDL吞噬能力;并用透射电镜观察MSCs超微结构改变.结果 VEGF在实验组中的含量显著高于对照组;直接接触共培养诱导MSCs表达Flk-1蛋白,且部分Flk-1阳性MSCs同时表达vWF蛋白;部分MSCs具有吞噬Dil-ac-LDL功能;电镜下见MSCs出现分化特征,核质比缩小,细胞器较为丰富,并可见细胞融合现象.结论 HUVECs可以通过细胞间直接接触诱导共培养的MSCs开始向内皮分化;其机制可能与细胞间直接接触促进细胞分泌VEGF以及细胞融合密切相关.     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。     

人脐血和脐带源MSCs分离培养难易及生物学特征的对比研究

目的 比较从人脐血和脐带中分离培养间充质干细胞（MSCs）的难易及两种不同来源MSCs的生物学特性,寻找最佳MSCs来源.方法 采用密度梯度离心法和组织块法分离培养人脐血MSCs和脐带MSCs.流式细胞术检测脐血和脐带源MSCs表面分子表型;采用丹参联合生长因子的方法诱导两种不同来源的MSCs向神经细胞分化.结果 脐带 MSCs原代分离培养成功率可达88%,而脐血MSCs分离培养成功率只有24%;脐带MSCs和脐血MSCs倍增时间分别为22h和38h;流式细胞术检测结果显示：两者具有相似的免疫表型,均表达黏附分子和基质细胞标记,不表达造血细胞标记、内皮细胞标记和HLA-DR;两种来源的MSCs在体外均可分化为樟经元样细胞.结论 脐带源 MSCs在生长速度、培养成功率上远高于脐血源 MSCs,在细胞表型及分化能力方面无差别.脐带 MSCs 是一种理想的 MSCs 来源.     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及其在血液系统疾病中的应用

间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞,在组织工程、基因治疗和造血干细胞移植领域具有较好的应用前景。骨髓是间充质干细胞的经典来源。近年研究显示,人脐带中也存在大量间充质干细胞,由于脐带来源间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富以及免疫原性低等优点,正逐渐成为间充质干细胞研究领域的热点之一。本文就其生物学特征、优势以及在血液系统疾病中的应用前景等予以综述。     

非病毒诱导体系高效诱导脐带来源间充质干细胞向胰岛细胞分化

目的探讨非病毒法诱导脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供临床移植数量级的细胞。方法从人脐带分离间充质干细胞,体外分阶段诱导分化为胰岛细胞。采用RT-PCR方法比较胰岛细胞分化过程中转录因子foxa2、sox17、pdx1、ngn3、pax4、insulin和glut-2在诱导组和非诱导组中的表达水平;免疫荧光染色方法检测胰岛素和C-肽在诱导终末阶段细胞中的表达定位;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胰岛素及C-肽的分泌以及细胞对葡萄糖刺激的反应性。结果诱导第1阶段末,诱导后细胞foxa2和sox17的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第2阶段末,诱导细胞pdx1、ngn3和pax4的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第3阶段末,诱导细胞的insulin和glut-2表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,胰岛素和C-肽均表达于诱导终末分化阶段的细胞,效率可达90%以上。ELISA检测结果显示,诱导第3阶段末细胞胰岛素总量为(346.3 739±32.5 149)μU/ml,明显高于未诱导细胞的(17.69...     

人脐带间充质干细胞体外修复子痫前期重度患者血清损伤后血管内皮细胞内分泌功能的研究

 目的探讨人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）在体外对子痫前期重度患者血清损伤后血管内皮细胞内分泌功能的影响。方法将人脐静脉内皮细胞株接种于6孔培养板,进行分组干预,分为无血清正常对照组（N组）、健康孕妇血清干预组（H组）和子痫前期重度患者血清干预组（P组）,每组均予UC-MSCs上清干预。采用ELISA法检测UC-MSCs干预前后细胞上清中ET-1和NO的含量。结果UC-MSCs干预前P组内皮细胞中ET-1含量最高,而NO最低;UC-MSCs干预后P组内皮细胞中ET-1含量下降,而NO升高;UC-MSCs干预前后P组ET-1和NO含量的差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论UC-MSCs在体外可修复子痫前期重度患者血清损害的内皮细胞的内分泌功能。     

无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用

目的 旨在探究无血清共培养条件下脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary gland epithelial cells,BMECs）的增殖作用。方法 选取生长状态最佳的UC-MSCs和BMECs,将两种细胞以直接接触和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UC-MSCs：BMECs分别为2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单纯培养组,并设阴性空白对照,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果 在48 h,条件培养基BMECs组A值显著高于对照组（P<0.05）,而1：2浓度组A值达到峰值,极显著高于对照组（P<0.01）,显著高于其他各浓度组和条件培养基BMECs组（P<0.05）。结论 无血清条件下,UC-MSCs和BMECs共培养可以促进BMECs增殖,直接接触促增殖效果优于间接接触,且最适比例为1：2,最佳时间是48 h。     

脐带间充质干细胞对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老实验研究

目的研究人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对D-半乳糖所致的亚急性衰老小鼠的抗衰老作用。方法对模型对照组和治疗组连续8周颈部皮下注射D-半乳糖(0.25 mg/10 g)以建立衰老模型,两周之后治疗组注射脐带间充质干细胞。检测脐带间充质干细胞治疗前后衰老相关指标:包括小鼠血清、肝组织、脑组织中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。结果模型对照组与治疗组相比,SOD、CAT偏低,MDA含量偏高并且存在显著性差异(P≤0.05),与空白对照组相比,则存在极显著性差异(P≤0.01)。结论脐带间充质干细胞能够显著改善D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的相关衰老指标,具有抗衰老作用。