基于PCR指纹技术鹿鞭鉴定方法的建立及检测试剂盒的研制

目的 建立鹿鞭及其伪品指纹鉴定方法,开发鹿鞭DNA检测试剂盒.方法 采用改良的SDS方法从鹿鞭及牛鞭基因组中提取DNA.以鹿鞭线粒体细胞色素b作为靶基因,设计鹿鞭特异性引物,利用现代DNA指纹技术,研制了鹿鞭DNA提取和检测试剂,建立鹿鞭指纹鉴定方法,开发出鹿鞭DNA检测试剂盒.结果利用PCR指纹技术提取的鹿鞭基因组DNA为21000 bp,纯度为1.80±0.10之间;应用特异性引物可准确鉴别鹿鞭及牛鞭样品,鹿鞭特异性扩增产物DNA分子片段为307 bp,而牛鞭及阴性对照无扩增条带;自主研发鹿鞭DNA检测试剂盒经反复冻融依然有效,多次进行特异性、稳定性和重现性试验,结果完全一致.结论 鹿鞭DNA检测试剂盒可作为鹿鞭鉴定的有效方法,该方法客观、准确、方便,可有效区分鹿鞭及其伪品.     

DNA微条形码技术在降解检材种属鉴定中的应用及法医学意义

【立题依据】 标准DNA条形码技术是基于COI基因序列分析而建立的一种物种鉴定方法,但由于目的基因扩增片段长达645bp,在法医物证降解检材中的应用受到限制。因此,本研究拟建立DNA微条形码技术,以解决法医物证特殊检材种属鉴定的难题。 【设计思路】 设计分别扩增不同近缘动物COI基因的通用引物,构建相应的复合扩增体系,并从种属特异性、林敏性、稳定性、案件适应性等方面进行验证。 【实验内容】 DNA提取及处理:有机溶剂法提取实验样本的基因组DNA;制备DNA<200bp的降解检材和两种动物DNA不同比例混合的混合检材。引物设计与合成:设计4对种属特异性引物和1对无种属特异性的ND3引物,并合成COI基因的标准引物。PCR扩增:①以10种动物基因组DNA为模板,分别用自行设计的4对引物进行扩增,以检验引物种属特异性;②以10种动物不同浓度基因组DNA为模板,分别用对应种属特异性的引物进行扩增,以检验引物扩增效能;③以降解检材基因组DNA为模板,分别用自行设计引物和标准引物进行扩增,以评估引物应用价值。PCR复合扩增:在确定自行设计引物特异性、扩增灵敏度的基础上,通过调整引物量和退火温度构建含有5对引物的复合扩增体系,并用于单一样本和混合样本基因组DNA的扩增。扩增产物检测:用聚丙烯凝胶电泳结合银染的方法检测各种动物模板DNA的扩增效果,以判定引物的扩增特异性和灵敏度,及降解检材和混合检材的扩增效果;用循环测序的方法获得各扩增产物的碱基序列,并通过BLAST软件与DNA数据库比对及遗传距离分析,判定检材的种属来源。 【实验材料】 常见家禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子)和常见家畜(水牛、黄牛、山羊、绵羊、马、驴、犬)共7科18种动物及人类血液样本各5例。 【可行性】 (1)不同种属动物COI基因序列可从相应DNA数据库获得;(2)熟练掌握引物设计的操作方法和PCR技术;(3)具备本研究所需的各种仪器、设备和试剂。 【创新性】 为法医物证降解检材的种属鉴定提供一种有效的方法。     

应用HRM技术进行法医昆虫种属鉴定的初步研究

目的对高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting,HRM)在昆虫种属鉴定中的有效性进行初步研究。方法提取绿蝇头部、胸部、腿部组织基因组DNA,设计特异性引物对其线粒体COI和16SrDNA区进行扩增检测,结果分别用HRM和DNA测序两种方法进行检测,对其结果进行比较。结果 HRM方法对COI和16SrDNA基因检测均获得了检测峰,DNA测序COI基因区测序成功,16SrDNA基因区因扩增量少未能成功测序;两种方法对实验样本的胸部、腿部和头部组织的检测结果具有较好的一致性。结论 HRM和测序两种方法具有较好的一致性,可用于法医昆虫的种属鉴定研究。     

广地龙特异性引物序列的设计及其混伪品的鉴别

目的?通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法?提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出广地龙的特异性引物,用于广地龙及其混伪品的鉴定。对PCR反应条件退火温度、循环次数、DNA模板量和Taq酶用量进行适应性考察。结果?COⅠ序列不存在特异性,不同物种、不同品种的动物药均可扩增出750?bp大小的片段,无法鉴定广地龙及其混伪品。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,设计出广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。在建立的PCR反应体系中,只有广地龙可以获得574?bp的基因片段,其他混伪品未扩增出相应条带。结论?设计的广地龙特异性引物可以准确、成功鉴别广地龙,与其他混伪品区分,为广地龙的品种鉴别提供了有效的方法。      

利用种特异性寡核苷酸探针对保健品中双歧杆菌种类的鉴定

目的研究种特异性寡核苷酸探针对保健品中双歧杆菌种类的鉴定效果。方法选取双歧杆菌三联活菌胶囊、科汉森双歧杆菌、加加宁口服液三种保健品,使用种特异性寡核苷酸探针对其属内菌种进行鉴定。结果 5种所测属内种中,双歧杆菌三联活菌胶囊主要包含婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌,不包含长双歧杆菌及青春双歧杆菌。科汉森双歧杆菌主要包含青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌,不包含长双歧杆菌及两歧双歧杆菌。加加宁口服液主要包含长双歧杆菌及青春双歧杆菌,婴儿双歧杆菌含量较少,不包含两歧双歧杆菌及短双歧杆菌。结论双歧杆菌三联活菌胶囊、科汉森双歧杆菌、加加宁口服液三种保健品分别含有不同种类的双歧杆菌,种类及含量等均有所差别。消费者及患者可根据自身需要选择合适的保健品。     

2型糖尿病患者与健康个体间肠道双歧杆菌的差异

目的研究2型糖尿病患者与健康个体之间肠道双歧杆菌是否存在差异。方法收集50例2型糖尿病患者和30例健康志愿者的粪便样品,提取样品中细菌总DNA,根据细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的属种特异性引物,并应用实时荧光定量PCR技术对两组人群粪便样品中的以上细菌进行定量检测和分析。结果 2型糖尿病患者组肠道双歧杆菌总菌和青春双歧杆菌的数量较健康对照组均显著减少(P<0.05)。结论 2型糖尿病患者肠道双歧杆菌数量减少。     

中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究

目的 本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据中华鳖和鳖甲混淆品原动物的125rRNA基因片段的序列数据库,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点,设计1对能特异性鉴别中华鳖的引物,然后利用鳖甲中残存的DNA,通过PCR拉增,即可准确鉴别鳖甲。结果 用这对引物对不同来源的10块鳖甲进行鉴定结果表明,其中有3块为伪品,结果与DNA序列分析鉴定一致。还测定了斑龟和鳖甲一伪品12SrRNA基因片段序列。结论 该引物配置药材鉴定试盒可在鳖甲类药材鉴定使用。     

鲑鱼精DNA提高人工突变质粒模板中单核苷酸多态性位点识别的特异性及其应用

目的探讨等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测单核苷酸多态性（SNP）的方法,研究鲑鱼精DNA对优化等位基因特异性引物的作用。方法对鲑鱼精DNA设一系列浓度梯度,分别进行AS-PCR后观察电泳结果。结果鲑鱼精DNA能显著提高识别基因SNP位点的特异性,在25μl的质粒检测系统中加入50 ng的鲑鱼精DNA结果最佳。结论鲑鱼精DNA加入到质粒检测系统中可有效测试所设计的检测引物的特异性,达到模拟基因组DNA的目的 。     

结核分支杆菌扩增体系的建立、优化及评价

目的 建立并优化结核分支杆菌PCR反应扩增体系,并对所建立的体系进行评价。方法根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,在Primer Premier V5．0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对,IB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。结果TBPCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。Mga2、引物以及dNTP在TBPCR体系中优化后最佳终浓度分别为：4mmnol／L、0．04μmol／L以及0．3mmol／L。TBPCR体系的退火温度优化后为55℃。,IB标准株及11B临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TBPCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝／止的DNA。结论TB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

黄花白及的SCAR分子标记转化研究

目的 建立黄花白及的SCAR标记,为黄花白及的分子鉴定提供科学依据。方法 用随机引物进行随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）标记筛选,获得特异的RAPD标记条带,经回收、克隆、测序后,根据RAPD标记条带的两端序列设计特异引物进行常规PCR反应,以获得序列特征化扩增区（sequence characterized amplified region,SCAR）标记。结果 利用50对随机引物筛选得到黄花白及的一条896 bp的特异片段,可以区别于小白及、独叶白芨和白及。该序列设计特异引物后,经过多次重复试验,该RAPD标记的特异片段已成功转化为SCAR标记。结论 建立的SCAR标记条带清晰明亮,结果稳定,可作为黄花白及分子鉴定的依据。     

基于ITS序列的紫芝分子鉴定

目的 建立基于ITS序列的紫芝分子鉴定方法.方法 分析20株灵芝属菌株ITS序列,设计紫芝的特异性引物.结果 用此引物对20株灵芝属菌株的DNA进行扩增,只有2株紫芝菌株有目的扩增条带.结论 设计的特异性引物有很高的专属性,能高度特异地鉴定紫芝菌株.     

PCR检测实验恒河猴和食蟹猴群体中幽门螺杆菌和“猕猴螺杆菌”的感染

目的调查国内实验恒河猴和食蟹猴中幽门螺杆菌和"猕猴螺杆菌"的感染情况。方法参考文献中的螺杆菌属16S rRNA和幽门螺杆菌16S rRNA的引物序列,和新设计的"猕猴螺杆菌"16S rRNA特异性引物,在人工养殖的45只成年恒河猴和90只成年食蟹猴粪便样本中,通过q PCR或常规PCR检测来初步调查这两种猕猴中两种螺杆菌的感染情况。结果在恒河猴中幽门螺杆菌和"猕猴螺杆菌"的感染率均为100%,在食蟹猴中幽门螺杆菌和"猕猴螺杆菌"的感染率分别为100%和97.8%。结论证实我国人工繁育饲养的恒河猴和食蟹猴普遍存在"猕猴螺杆菌"感染。幽门螺杆菌和"猕猴螺杆菌"几乎同时存在于所有人工繁育的实验猴个体中,可能会对这两种猕猴的健康以及相关动物实验结果的准确性存在不利影响。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

AS-PCR法鉴别炮制辅料鳖血和常见掺伪品的研究

  目的  建立一种炮制辅料鳖血等位基因特异性PCR(AS-PCR)鉴别方法, 快速、准确地鉴别鳖血与其它常见动物血液。  方法  通过比较鳖血基原中华鳖和驴、牛、羊、鸡、猪、兔为代表的常见动物的CO Ⅰ序列差异, 根据SNP位点设计鳖血特异性鉴别引物, 优化PCR反应体系, 并进行耐受性、适用性、掺伪灵敏度考察验证。  结果  实验条件为退火温度62 ℃、循环次数29次、引物用量0.2 μL、DNA模板浓度100 ng时, 鳖血使用设计的ZHB286引物经PCR扩增和凝胶电泳后出现约286 bp的明亮条带, 其他动物血液样品均无条带出现。  结论  该AS-PCR鉴别方法具有高度特异性, 能准确鉴别鳖血和其他常见动物血液, 进而可用于鳖血与驴、牛、羊、鸡、猪、兔血掺伪鉴别, 在血液类药材分子鉴定中具有广泛应用价值。      

食源性致病菌沙门氏菌与奇异变形杆菌二重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测食物中致病菌奇异变形杆菌与沙门氏菌的双重PCR方法。方法根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）和沙门氏菌属侵袭性抗原保守基因（invA）设计特异性引物,建立其双重PCR检测方法,并对反应条件进行优化。结果两对引物分别能扩增出374 bp和724 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,两菌可同时检出的浓度限度为104cfu/ml。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食物中奇异变形杆菌与沙门氏菌的快速诊检和监控。     

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

目的 建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,实现对冬虫夏草的快速检测。方法 针对冬虫夏草的CS2 serine protease (csp2)基因设计LAMP内外引物对;利用CTAB法提取冬虫夏草DNA;优化扩增反应条件;采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增,并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性,通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度;紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果 设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增,产物可被限制性内切酶Taq1酶切,且有较高的灵敏度,检出限达6 pg/mL。结论 LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测,在中药鉴定中有着广阔的应用前景。     

基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

【目的】设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,筛选出适合芯片检测的高敏感性和特异性寡核苷酸探针。【方法】根据梅毒螺旋体特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。提取梅毒螺旋体的DNA,采用通用引物联合标记法进行标记,标记样品与芯片杂交,用芯片扫描仪检测杂交结果。【结果】设计出23条50 mer梅毒螺旋体寡核苷酸探针。标记样品与芯片杂交部分探针有较强的杂交信号,并筛选出符合要求的9条梅毒螺旋体寡核苷酸探针。【结论】以上方法能设计和筛选出敏感性和特异性较高的梅毒螺旋体寡核苷酸探针,可用于制备梅毒螺旋体寡核苷酸芯片。     

实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的方法及实验影响条件，为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000 PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品，摸索最佳扩增条件及建立标准曲线，然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶，比较普通Taq酶而言。提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定：95℃10min后95℃5s，53℃30s，40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件，建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。