基于ITS序列PCR-RFLP鉴别木香、川木香和藏木香

  目的  利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术, 建立快速鉴别木香、川木香和藏木香的方法。  方法  通过比对木香、川木香和藏木香3个物种ITS基因序列, 筛选限制性内切酶并设计鉴别引物。优化PCR扩增和酶切反应条件, 并进行方法学考察和统计学分析。  结果  退火温度为60 ℃、循环数为30时, 能检出500~750 bp单一DNA条带; 底物为10 μL、酶切时间为15 min时, BsaHⅠ酶可将木香、川木香及藏木香在一定范围内切割成大小不一的DNA条带, 方法学和统计学结果较好。  结论  建立的PCR-RFLP方法能够准确地鉴别木香、川木香及藏木香3种药材, 避免此3类药材的混用, 保证临床用药安全。      

追踪随访布鲁菌病患者PCR实验室诊断方法的建立

目的：　建立布鲁菌单一PCR实验室检测方法,并在模拟样本和染毒动物实验中优化反应条件,为将PCR方法应用于布鲁菌病患者治疗后的追踪随访提供实验室依据。 方法：　针对编码BP26的基因序列设计布鲁菌属引物,针对插入性序列IS711设计区分布鲁菌羊种、牛种和猪种引物;以M5或M5荧光菌株为实验组、以PBS为对照组制备系列浓度的模拟样本和染毒动物;用热解法从血液样本中提取布鲁菌基因组;用BP26与羊种、牛种和猪种引物对菌液进行PCR扩增,用BP26和羊种引物对模拟样本和染毒动物不同时间点的血液样本进行检测。结果：　菌属水平引物BP26和不同种引物在对布鲁氏菌标准菌株、疫苗株基因组的扩增中均得到特异性条带,具有一定的特异性;热解法可提取到模拟样本和染毒小鼠血液样本中的布鲁菌基因组,经PCR扩增后得到特异性条带;染毒小鼠血样PCR检测阳性结果数随时间先上升后下降,同一时间点增加样本量可提高阳性率,热解法在各时间点检测阳性率均高于同期化学试剂法提取结果,PCR检测方法灵敏度高于分离培养方法。 结论：采用热解法提取血液样本中的布鲁菌基因组,易于操作;PCR检测方法安全稳定,敏感性高于传统分离培养方法;以核酸为靶标进行检测的特异性较高,可进一步应用于患者治疗后追踪随访研究。     

PCR法检测粪便样本溶组织内阿米巴的初步研究

  目的  建立直接检测粪便样本中溶组织内阿米巴的PCR方法。  方法  根据溶组织内阿米巴标准株基因组中小亚基核糖体RNA（small subunit ribosome RNA,SSU rRNA）序列合成4对特异性引物（2对自主设计引物和2对参考引物）,建立PCR检测方法,用该方法对221例临床腹泻患者粪便标本进行检测,同时采用病原学碘染涂片镜检法和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗原,对3种方法的阳性率进行比较,并采用Kappa检验进行一致性分析,分析3种检测方法结果的准确性。  结果  4对引物均扩增出溶组织内阿米巴特异的目的片段,建立了粪便样本溶组织内阿米巴检测的PCR法。选择其中2对引物（1对自主设计引物和1对参考引物）对221例粪便样本进行PCR扩增,同时用碘染涂片镜检法查病原体,用ELISA法进行抗原检测,3种方法溶组织内阿米巴阳性检出率分别为2.26%、0.90%和9.50%,差异有统计学意义（χ2=23.34, P<0.01）。PCR法与碘染涂片镜检法比较,Kappa值为0.216,一致性微弱;PCR法与ELISA法比较,一致性差,Kappa值为–0.134。PCR法的结果与临床诊断的一致性最好。  结论  本研究通过自行设计引物建立的粪便样本溶组织内阿米巴PCR检测法在准确性上优于镜检法和ELISA抗原检测法,为该方法用于临床诊断提供了实验基础。     

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

  目的  利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。  方法  针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab（ORF1ab）基因序列保守区设计引物，获得了 RT-LAMP 检测体系，并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。  结果  经检测新型冠状病毒核酸标准物质，其结果与预期相符，证实了该检测体系的可行性。  结论  利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高，适用于边境条件有限地区。     

基础医学模式生物酿酒酵母接合型的鉴定—PCR法

目的:利用PCR法鉴定酿酒酵母a、α单倍体或a/α双倍体三种接合型。 方法:根据酿酒酵母a、α或a/α三种接合型MAT基因座及附近序列信息,分别设计特异的寡核苷酸引物。提取酿酒酵母DNA作为模版和利用单菌落PCR法,进行特异性PCR扩增。 结果:MATa基因座特异性引物能在a和a/α接合型中扩增出特异性条带;MATα基因座特异性引物则能在α和a/α接合型中扩增出特异性条带。 结论:利用PCR鉴定酿酒酵母接合型是一种操作简单,准确灵敏的方法,为基础医学单细胞真核模式生物的研究提供方便。     

麝香蛋白性掺伪物的化学鉴别

麝香为麝科动物林麝MoschusberezorskiiFleror马麝Moschussifanicusprzenrralskii或原麝MoschusmoschiferusLinaeus成熟雄体香囊中的干燥分泌物（1）。由于它的珍稀贵重，故其假冒伪劣常有出现，严重影响用药的安全有效。传统经验鉴别对其真伪的判断提供了许多有价值的方法，但对掺伪及掺伪量不易判断（2）。当掺伪物为植物性或矿物性物质时．运用显微鉴别方法可准确识别及初步到明掺伪量（3）。但笔者在实际工作及实验中常见的是动物性掺伪物，如血块、蛋黄、肝组织、奶渣、肌肉等。这些掺伪物与麝香在显微镜下的性状征易混淆，不易区分…     

广地龙特异性引物序列的设计及其混伪品的鉴别

目的?通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法?提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出广地龙的特异性引物,用于广地龙及其混伪品的鉴定。对PCR反应条件退火温度、循环次数、DNA模板量和Taq酶用量进行适应性考察。结果?COⅠ序列不存在特异性,不同物种、不同品种的动物药均可扩增出750?bp大小的片段,无法鉴定广地龙及其混伪品。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,设计出广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。在建立的PCR反应体系中,只有广地龙可以获得574?bp的基因片段,其他混伪品未扩增出相应条带。结论?设计的广地龙特异性引物可以准确、成功鉴别广地龙,与其他混伪品区分,为广地龙的品种鉴别提供了有效的方法。      

鉴别金钱白花蛇药材及其伪品的PCR方法研究

目的:探讨鉴别金钱白花蛇药材及其伪品的PCR方法。方法:利用PCR方法对金钱白花蛇正品药材及四种伪品进行鉴别分析。结果:利用PCR方法进行检测得出以下结果:第一,上述5种样本的收集无误符合实验要求,基于细胞色素C氧化酶I基因序列所进行的引物设计均能够顺利实现实验样品的扩增。第二,当退火温度保持在55℃与63℃之间时58℃以下的各样品检测条带较为清晰;当Mix的用量处于27μl到33μl之间时,29μl用量下可以较为清晰的反映各样品检测条带并且均为特异性扩增。优化后的反应体系为:2×Taq PCR Master Mix29μl、正反向引物8μl、ddH2O9μl、模板DNA共4μl。第三,在进行灵敏度与特异性检测后可知:5种蛇类样品均出现单一模板下的特异性单一条带以及在混合模板下出现了5条条带。当样品的DNA模板浓度为0.1ng/μl时尚可发现有扩增的条带,即,可推断其灵敏度已达到皮克级。结论:PCR鉴别方法的特异性与灵敏度均较高,能够快速进行检测,值得在临床应用上进行推广。     

简并引物q-PCR法检测新疆喀什地区羊肝组织中细粒棘球绦虫

目的 建立检测新疆喀什地区羊肝组织中细粒棘球绦虫的分子生物学方法,提高包虫病的早期诊断水平。方法 对羊肝组织内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体cytochrome b基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,引物设计考虑简并碱基。结果 建立的简并引物q-PCR法特异性好,与常见的宿主动物（羊、驴和犬）基因组无交叉扩增现象,与肝内的常见寄生虫（肝片吸虫和莫尼茨绦虫）基因组无交叉扩增。梯度稀释的基因组DNA:10 ng、1 ng、100 pg、10 pg进行qPCR实验均能得到标准的S型曲线。PCR体系R²=0.984,效率：92.6%,符合qPCR的相关要求。结论 线粒体基因组的cytochrome b基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。喀什地区首次应用简并引物q-PCR法检测细粒棘球绦虫,灵敏度高,特异性好,为下一步对该地区进行包虫病分子流行病调查提供了技术支撑。     

简并引物q-PCR法检测新疆喀什地区羊肝组织中细粒棘球绦虫

目的 建立检测新疆喀什地区羊肝组织中细粒棘球绦虫的分子生物学方法,提高包虫病的早期诊断水平。方法 对羊肝组织内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体cytochrome b基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,引物设计考虑简并碱基。结果 建立的简并引物q-PCR法特异性好,与常见的宿主动物（羊、驴和犬）基因组无交叉扩增现象,与肝内的常见寄生虫（肝片吸虫和莫尼茨绦虫）基因组无交叉扩增。梯度稀释的基因组DNA:10 ng、1 ng、100 pg、10 pg进行qPCR实验均能得到标准的S型曲线。PCR体系R²=0.984,效率：92.6%,符合qPCR的相关要求。结论 线粒体基因组的cytochrome b基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。喀什地区首次应用简并引物q-PCR法检测细粒棘球绦虫,灵敏度高,特异性好,为下一步对该地区进行包虫病分子流行病调查提供了技术支撑。     

基于体外补血活性测定的当归品质评价新方法探索

  目的  建立一种基于补血活性的生物学评价方法, 通过与当归的主要药效相关联, 对其内在品质进行评价。  方法  以氯化血红素为标准品, 用联苯胺染色法测定当归作用于K562细胞后的血红蛋白含量, 通过量反应平行线测定法计算效价, 完成方法学考察并以此比较不同产地、不同炮制方法当归饮片的效价。  结果  当归样品可靠性检验显示, 回归项有显著差异(P＜0.01);方法学考察中重复性和精密度RSD分别为1.13%、4.73%;不同产地当归饮片补血效价为399.61~8 920.32 U·mg-1, 不同炮制方法当归饮片补血效价排序为生当归＞土炒当归＞酒当归, 不同入药部位当归饮片补血效价排序为当归身＞当归头＞当归须。  结论  所建立的当归饮片补血生物效价方法稳定可靠, 方法学考察结果符合《中国药典》2020年版“中药生物活性测定指导原则”相关要求, 可用于不同产地、不同炮制方法、不同入药部位的当归饮片补血疗效的评价, 为进一步完善当归质量评价与控制提供了新思路和新方法。      

土鳖虫醇提蛋白的分离纯化及其体外抗肝癌与抑制肝纤维化活性研究

  目的  采用体外细胞实验评价土鳖虫醇提物中大分子蛋白各分离产物的抗肝癌与抑制肝纤维化活性, 明确土鳖虫的有效部位与成分。  方法  采用盐析法从土鳖虫醇提物中回收蛋白类成分, 将土鳖虫粗蛋白产物按分子量差异进行超滤, 将其分为EEPA、EEPB及EEPC三个不同的蛋白部位, 以抑制肝异常细胞增殖活性为导向, 筛选最佳活性蛋白部位; 接着经过DEAE阴离子层析及Sephadex G-100凝胶层析对活性粗蛋白部位进一步的纯化, 从EEPC中分离出一种纯化蛋白PC3-Ⅲ, 并对其进行LC-MS/MS分析; 最后利用细胞实验评价EEPC及PC3-Ⅲ体外抗肝癌及抑制肝纤维化的活性。  结果  在EEPA、EEPB及EEPC中, 分子量最大的蛋白部位EEPC表现出最高的抑制肝异常细胞增殖活性; 纯化蛋白PC3-Ⅲ分子量为10 kDa左右, 经LC-MS/MS鉴定表明,PC3-Ⅲ对同源蛋白A0A0M3STY1的覆盖率达到35%, 查库得到的肽段序列为QYSINFISAR、CNGDSCVCTFR和SNNFR; 体外细胞实验证明PC3-Ⅲ不仅通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移来共同发挥抗肝癌药效, 还能抑制活化的肝星状细胞增殖从而延缓肝纤维化的进程, 疗效与EEPC相当。  结论  研究证实了土鳖虫大分子蛋白的抗肿瘤与抗肝纤维化的活性, 并分离得到均一蛋白产物PC3-Ⅲ, 为推进土鳖虫功效物质基础的认识与相关产品研发奠定了基础。      

全程输血质量管理在血液标本2次血型鉴定结果不一致中的应用研究

  目的   回顾性分析开展“全程输血质量管理”前后血液标本2次血型鉴定结果不一致情况，调查分析原因，提出改进措施，保障临床用血安全。  方法  对比分析昆明医科大学第二附属医院开展“全程输血质量管理”前3 a（2015年1月至2017年12月）及后3 a（2018年1月至2020年12月）血液标本2次血型鉴定结果。   结果  2015年至2020年一共进行120 023例2次血型鉴定，共46例血液标本2次血型鉴定结果不一致，发生率0.038%，其中前3 a 34例，发生率为0.061%，后3 a 12例，发生率为0.019%（P < 0.05）。调查分析相关因素，在实施“全程输血质量管理”前3 a，患者身份识别错误是主要原因，主要责任人为护士。而在实施“全程输血质量管理”后3 a患者借用他人医保卡信息是主要原因，主要责任人为患者。  结论  通过开展“全程输血质量管理”，严格执行操作规程，实施同一患者血型和交叉配血2份血液标本检测结果比对的安全措施可有效降低输血风险。     

Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌OprD基因突变分析

  目的  研究对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（carbapenem-resistant but cephalosporin-susceptible ,Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中OprD基因的突变类型。  方法   对2021年1月至2021年3月昆明医科大学第一附属医院临床分离的10株对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感的铜绿假单胞菌进行分离培养;使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测该表型铜绿假单胞菌中OprD基因的携带情况,并测序分析OprD基因的突变类型。  结果   10株菌株均显示出明显的OprD扩增条带,测序分析显示有以下突变类型,分别是移码突变2株、氨基酸替代突变8株、提前终止密码子2株、大片段缺失4株。  结论   对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌中OprD基因的突变类型呈多样化,点突变频率最高,还有大片段的缺失以及提前终止密码子。这些突变导致OprD结构发生改变,从而使得耐药现象的发生。     

宏基因组测序在临床重症感染患者寻找病原体中的应用

  目的  应用宏基因组测序检测重症患者感染病原体,了解在重症患者中的应用对寻找感染病原体的帮助。  方法  对1例表现为腹痛、逐渐进展至意识障碍合并严重感染的急性重症胰腺炎患者,用传统方法检测病原体的同时应用宏基因组测序。传统方法包括:常规涂片、培养,VitekII Compact全自动微生物鉴定和药敏分析,实时荧光定量PCR检测病毒载量,以及免疫组织化学等病理检查。宏基因组测序则采用基于BGISEQ-100高通量测序平台的二代测序,剔除人类宿主序列后,将保留下来的序列与包含病毒、细菌、真菌和寄生虫基因组序列的微生物基因组数据库进行比对,确定标本中所有的病原体。  结果  传统检验发现该患者感染了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌。宏基因组测序结果不仅检出了前述病原体,还检查出了加重疾病恶化的巨细胞病毒（CMV）,耗时约5 d。实时荧光定量PCR补充病毒载量检测证实其CMV载量为189 000 copies/mL。  结论  在本例重症患者中,宏基因组测序一次性快速准确检出了3种病原菌和1种病毒,可辅助重症患者感染病的快速诊断。     

不同产地山羊角多类型资源性化学成分分析及差异研究

  目的  分析不同产地山羊角中多类型资源性化学成分差异, 为其资源利用提供依据。  方法  分别采用超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、分光光度法对32批不同产地山羊角中核苷类及氨基酸类成分、水溶性蛋白、含巯基类化合物、无机元素类成分含量进行分析评价; 利用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别法(PLS-DA)对山羊角产地差异进行综合评价。  结果  山羊角中检测出9种核苷类成分、18种游离氨基酸类成分, 核苷类成分平均总量为20.88 μg · g-1, 氨基酸类成分平均总量为642.41 μg · g-1; 山羊角中水溶性蛋白、总巯基和游离巯基类成分的平均含量分别为51.07 mg · g-1,22.48 μmol · g-1,9.97 μmol · g-1;山羊角中检测出常量元素5种,必须微量元素9种,重金属元素4种, 平均总量分别为45.09 mg · g-1,295.32 μg · g-1,7.74 μg · g-1; PCA和PLS-DA结果表明, 基于48种化学成分分析结果, 不同产地山羊角存在显著差异, 西南地区产山羊角与华东、华北地区产山羊角差异较大, 华东地区产山羊角综合得分较高。  结论  不同产地山羊角所含资源性成分种类基本一致, 但各类型成分含量差异较大, 华东地区产山羊角资源性成分含量相比其他产区较高, 研究结果可为山羊角药用产地选择及综合利用提供一定参考。      

人体血液中丙酮对乙醇检测结果的影响

  目的  研究血液样品中丙酮对乙醇定性定量结果的影响。  方法  采用顶空气相色谱法（双柱双检测器）测定600例涉嫌酒后或醉酒驾车驾驶员血液样品中的乙醇及丙酮。  结果  色谱柱1（DB-ALC1）可将内标叔丁醇和丙酮有效分离，而色谱柱2（DB-ALC2）不能将丙酮与内标叔丁醇分离，干扰乙醇定量结果的准确性。采用GC-MS法对疑似含有丙酮的部分血样进行确证，均检出丙酮成分，顶空气相色谱法对113例血样中丙酮进行定量分析，血样中丙酮含量最高为6.55 mg/100mL。  结论  法医学鉴定中应关注丙酮对乙醇检测结果的影响，为准确判定酒驾、醉驾案（事）件性质，应采用双柱双检测器进行乙醇定性判定，在血液样品中存在丙酮干扰时，采用DB-ALC1色谱柱测定的平均值作为定量结果。     

云南白族民家支系18个常染色体STR位点的遗传多态性

  目的  调查云南白族民家支系2 323个健康无亲缘关系个体18个STR基因座的遗传多态性,计算群体遗传学参数,建立云南白族民家支系群体的遗传学基础数据,为司法鉴定工作中的亲子鉴定和个体识别提供可靠的科学依据。  方法  收集2323份云南白族民家支系人群无关个体样本,采用DNATyperTM19试剂盒,进行直接PCR复合扩增,用AB 3130XL自动遗传分析仪进行毛细管电泳分离,用GeneMapper ID-X 1.5软件对分离的STR进行分型。使用Modified-Powerstats软件统计等位基因频率,进行Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验,计算匹配概率等法医学参数。使用Arlequin软件计算Fst和P值。使用Phylip软件计算Nei’s遗传距离。使用SPSS软件进行多维尺度（MDS）分析。应用Mega软件构建相邻连接（NJ）系统发育树。  结果  18个STR基因座中共观察到230个等位基因和1073种基因型。除D13S317基因座不符合Hardy-Weinberg平衡（P = 0.0008）外,其余基因座等位基因频率和基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05/18 = 0.0028）。18个STR基因座的累积个人识别能力（CDP）达0.999999999,累积非父排除概率（CPE）达0.99999994055。Fst值、Nei's遗传距离以及NJ系统发育树的结果均提示,白族民家支系与云南布朗族和云南佤族相距较远,而与大理白族和怒江白族相距较近。  结论  上述18个STR基因座在云南白族民家支系群体中具有高度多态性,可用于司法鉴定和群体遗传结构研究。