大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析

目的研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。     

大鼠肝卵圆细胞的形态学及免疫组织化学特征研究

肝卵圆细胞等肝干细胞有可能在肝衰竭及遗传性肝病治疗中发挥重要作用[1 ] 。我们在已建立的大鼠肝卵圆细胞增殖模型基础上 ,对大鼠肝卵圆细胞的形态学参数及细胞表型等生物学特征进行研究。一、材料与方法1.大鼠模型建立 :按照我们建立和改进的方案[2 ] ,选择体重 15 0 ｇ左右的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (第三军医大学动物研究所提供 ) ,2～ 3个月龄 ,实验前单只分笼饲养 1周以上。实验大鼠通过胃管灌喂2 乙酰氨基芴 (ＡＡＦ ,Ｓｉｇｍａ公司产品 ) ,每天 1次 ,连续 4ｄ ,第 5天在戊巴比妥全身麻醉下行 2 3肝切除 (手术当日不灌喂ＡＡＦ) ,…     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养和体外分化研究

目的 观察大鼠肝卵圆细胞的活化，为进一步研究肝卵圆细胞特征建立简单的分离培养方法。方法 利用2-乙酰氨基笏／部分肝切除建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，采用选择性消化法从该模型中分离纯化肝卵圆细胞，并做免疫细胞荧光鉴定。用丁酸钠诱导其分化。结果 成功地建立了肝卵圆细胞活化模型，并从中分离培养了表达OV6、CK19、AFP、白蛋白、c-kit、Thy1、CD45和CD34的卵圆细胞。在丁酸钠刺激下它可向肝细胞分化。结论 利用选择性消化法可以分离到肝卵圆细胞，并且其具有肝干细胞的特征。     

骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及肝内移植研究

目的 观察体外诱导骨髓问充质干细胞分化及肝纤维化形成环境中移植情况。方法 首先行骨髓间充质干细胞提取、分离和培养，加入肝细胞生长因子（HGF，20μg／L）和表皮生长因子（EGF，1．5mg／L）诱导定向分化。肝纤维化形成的大鼠随机分成2组，每组10只。使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记诱导的骨髓间充质干细胞，经门静脉向肝纤维化形成的SD大鼠肝脏移植，对照组用BrdU标记未经诱导的骨髓间充质干细胞。2周后通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏标记细胞的分布及BrdU^＋／ALB^＋细胞数量。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化的细胞CK8及ALB表达阳性。移植2周后大鼠肝脏均可检测到BrdU标记细胞，与对照组相比诱导后骨髓问充质干细胞组BrdU^＋／ALB^＋细胞数较多，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 经体外诱导骨髓间充质干细胞能分化为肝细胞，移植在大鼠肝纤维化形成环境中，白蛋白表达细胞数更多。     

不同体积肝脏移植疗效的实验研究

我们拟通过体外减体积法获得小体积供肝,以探讨大鼠不同体积的原位肝脏模型的建立方法及疗效。一、材料和方法雄性SD大鼠,周龄6～12周,体重2 40g左右。自由进食水,12h昼夜生活环境。采用浓度为0 .6%的苯巴比妥钠,按每公斤体重3 0～5 0mg给予腹腔内注射。全肝脏移植供肝获取按Kamada方法[1] 。5 0 %和3 0 %左右大小的小体积供肝的获取是首先按全肝脏移植时的方法获取全肝,然后,在体外即保存液中依次切取尾状叶,三角叶和左外叶。对于5 0 %体积大小供肝脏移植物,保留肝右叶和肝中叶。对于3 0 %体积大小供肝,要同时切除肝右叶,只保留肝中叶作…     

大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞在2-AAF/PH模型中的增殖及关系研究

目的 研究大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞增殖过程中关系,探讨肝星状细胞(HSCs)对卵圆细胞增殖分化的调控作用.方法 利用2-乙酰氨基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型,对术后不同时间点的肝组织标本进行常规组织学观察,并用卵圆细胞标志物OV-6和HSCs激活标志物desmin进行免疫组化染色和免疫荧光双标,对阳性细胞进行半定量计数并分析两者相关性.结果 PH后第2天,门静脉区域开始出现小管样结构的卵圆细胞和HSCs增殖;PH后第4～6天,HSCs形成网格状伴随卵圆细胞迅速增殖,向肝实质内侵入;PH后第9天,HSCs与卵圆细胞增殖达到顶峰;PH后第12～15天,出现新生小肝细胞结节及小肠样化生,HSCs随卵圆细胞显著减少,位于小肝细胞结节周围,结节内有少量HSCs;PH后第18～21天,HSCs与卵圆细胞进一步减少或消失.直线相关分析表明两者高度相关.结论 HSCs参与了肝卵圆细胞介导的肝再生,可能通过产生多种生长因子以及重塑胞外基质对卵圆细胞的增殖分化具有重要的调控作用.     

大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定

目的：分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞。方法：以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定。结果：改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin。结论：改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据。     

肝卵圆细胞对大鼠肝硬化组织TGFβ/smad信号传导的影响

【摘要】〓目的〓探讨肝卵圆细胞对TGFβ/smad信号传导通路影响的机制,并证明肝卵圆细胞对肝硬化的发展是否有阻止和逆转的作用。方法〓对肝卵圆细胞进行增殖、分离、培养后,移植于肝硬化大鼠肝脏组织,以未经移植的大鼠做对照,分别进行组织病理学和肝功能及蛋白表达水平的检测,分析ALB、AST、ALT、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad4 、Smad7的情况。结果〓移植肝卵圆细胞的鼠肝硬化组织纤维化减少,肝功能明显改善(P<0.05),肝硬化组织TGFβ/smad信号通路中各蛋白表达量有差异。结论〓肝卵圆细胞刺激肝硬化细胞后TGFβ/smad信号通路中各蛋白的表达是不同的,肝卵圆细胞对肝硬化组织有阻止和逆转的作用。     

肝脏胞外基质成分参与卵圆细胞介导的肝再生

目的 探讨肝再生中肝脏胞外基质成分与卵圆细胞的相互关系及作用.方法 采用免疫组化及免疫荧光双标的方法动态观察大鼠卵圆细胞增殖模型中肝脏胞外基质成分(层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的定位及与卵圆细胞的关系. 结果 肝部分切除后第2天,卵圆细胞开始向门静脉周围区域增殖.层粘连蛋白主要出现在门静脉周围的肝窦状隙内,纤维连接蛋白在整个肝小叶内表达显著增加.术后第4～9天,卵圆细胞进一步向肝实质内增殖,门静脉周围纤维连接蛋白表达增加,中央静脉周围表达减少.层粘连蛋白及纤维连接蛋白与卵圆细胞关系紧密.术后第12～15天,随着卵圆细胞分化为小肝细胞结节,大多数层粘连蛋白及纤维连接蛋白位于结节周边,少数出现在结节内.第18天以后,正常的肝小叶结构开始恢复.结论 卵圆细胞与肝脏胞外基质成分存在紧密联系;局部肝脏微环境可能通过细胞与基质之间的相互作用在卵圆细胞介导的肝再生中发挥重要的调控作用.     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立和体外分离的实验研究△

目的探讨以2-乙酰氨基芴（2-AFF）灌胃与2／3肝切除法联合运用建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的适宜剂量,并探讨肝卵圆细胞的体外分离培养方法。方法将174只Wistar大鼠随机分为4个实验组（各30只）、未处理组（24只）和生理盐水组（30只）。4个实验组大鼠分别给予5、10、15及20mg／（kg·d）2-AAF灌胃（分别对应第1、2、3及4实验组）,于第5天行2／3肝切除,术后继续灌胃至处死大鼠;生理盐水组大鼠以生理盐水灌胃,其余操作同实验组;未处理组大鼠不做任何处理。6组分别于肝切除术后第4、8、12及16天各随机处死6只大鼠,取肝组织行HE染色和免疫组化染色,观察肝卯圆细胞的增殖情况[第4天时同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AsT）水平];并采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法对大鼠肝卵圆细胞进行分离和培养。结果肝切除术后第4天,未处理组、生理盐水组、第1、2、3及4实验组大鼠的存活率分别为100％（24／24）、93％（28／30）、93％（28／30）、90％（27／30）、90％（27／30）及80％（24／30）。肝切除后第4天,与未处理组及生理盐水组比较,第2、3和4实验组大鼠的血清ALT及AST水平均升高（P〈0.05）。HE染色结果显示,第2、3及4实验组大鼠的肝组织均出现不同程度的肝损伤,其中第3和第4实验组均可见明显的肝卵圆细胞增殖反应;免疫组化染色结果显示,第2、3及4实验组卵圆细胞标志6（OV-6）表达阳性细胞数在术后第4、8、及12天,随2．AAF剂量的增加逐渐升高,与2-AAF间呈剂量嫩应关系（P〈0.05）。大鼠肝卵圆细胞进行体外分离和培养后,经OV-6免疫组化染色鉴定,有80％的细胞表达呈阳性。结论联合运用15mg／（kg·d）2-AFF灌胃加2／3肝切除,于术后第12天,有效诱导了肝卵圆细胞的增殖,且造模大鼠的耐受性较好、死亡率低。采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法较成功地分离出了大鼠肝卵圆细胞。     

骨髓基质干细胞分化来源肝细胞移植的细胞准备及组织学观察

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞向肝细胞分化后体外标记方法及移植肝细胞的肝内组织学表现。方法 分离大鼠骨髓基质细胞，在体外诱导分化为成熟肝细胞。将5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入后的肝细胞移植入已行部分肝切除大鼠体内，分别应用免疫组织化学和免疫荧光方法观察受体肝脏内移植细胞的形态和功能。结果分化成熟肝细胞在BrdU掺入培养后细胞核染色可见特异性棕褐色标记；肝细胞移植后肝组织切片BrdU染色可定位移植细胞；白蛋白抗体染色显示移植细胞具有功能活性。结论 骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞移植后形态功能稳定，是进行肝细胞移植的理想细胞来源。     

表皮生长因子对卵圆细胞p21ras蛋白表达的影响

卵圆细胞 (OVC)为肝脏的干细胞 ,与肝癌发生关系密切[1,2 ] 。我们应用Westernblot法通过对大鼠肝脏卵圆细胞在表皮生长因子 (EGF)干预下 p2 1ras表达的影响进行比较分析 ,同时运用四唑盐比色法 (MTT)法观察细胞活力 ,以揭示EGF对卵圆细胞活性及 p2 1ras蛋白表达变化的影响。一、材料与方法1.材料 :SD大鼠 6只 ,体质量 (12 0± 2 0 )g ,第一军医大学动物所提供。 3’ 甲基 4 二甲基偶氮苯 (日本东京化成工业株式会社 ) ,脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸 (美国Sigma公司 ) ,F12及DMEM /F12 (1∶1) (美国Gib co公司 ) …     

骨髓源性肝干细胞定向分化及脾内移植研究

目的　寻找骨髓源性肝干细胞的表面标记 ,进行定向分化及脾内移植研究。方法　流式细胞仪检测淤胆大鼠骨髓中干细胞群体的数量变化 ,寻找肝干细胞标记 ,免疫磁珠分离 ,进行体外诱导分化和肝再生模型的脾内移植 ,观察细胞形态的变化 ,免疫组织化学和免疫荧光技术检测白蛋白、AFP、CK8/18等肝细胞标记的表达。结果　淤胆鼠 β2微球蛋白阴性 (β2 m-)细胞数量较对照组数量明显增高 ,分别为 (6.17± 2 .70 ) %和 (0 .79± 0 .61) % (P <0 .0 1) ,β2 m-细胞体外培养及脾内移植均可出现肝细胞样细胞 ,白蛋白、AFP、CK8/18表达阳性。结论　β2m 细胞在体内外具有向肝细胞分化的能力 ,脾内移植是肝干细胞移植可供选择的部位之一。     

无白蛋白受体鼠中源于移植肝非实质细胞的肝细胞功能研究

目的研究F344大鼠来源的肝非实质细胞(LNPCs)能否驻存于γ射线全身照射的先天性无白蛋白大鼠(F344alb)的骨髓,进而转化为产白蛋白肝细胞。方法研究分为5组：无细胞移植和γ射线全身照射组(组I,n=5)；接受γ射线全身照射,无细胞移植(组Ⅱ,n=5)；移植1×10~7 LNPCs,无γ射线全身照射(组Ⅲ,n=5)；γ射线全身照射后移植1×10~7 LNPCs(组Ⅳ,n=5)；γ射线全身照射后移植1×10~7骨髓细胞(BMCs,组Ⅴ,n=5),8周后,处死大鼠。肝脏切片行白蛋白免疫染色,检测呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA和血清中自蛋白的水平。结果(1)生存率：接受LNPCs移植的γ射线全身照射F344alb(组Ⅳ)平均存活率83．3%,而仅γ射线全身照射的F344alb存活率为20．0%(组Ⅱ),同时接受BMCs移植的γ射线全身照射F344alb平均存活率的的达100．0%(组Ⅴ)。(2)白蛋白阳性肝细胞呈多于6个的簇状分布仅发现于γ射线全身照射后接受LNPCs或BMCs移植的肝切片中(组Ⅳ和组Ⅴ)。(3)从F344alb受体(组Ⅳ和组Ⅴ)骨髓细胞及肝脏切片中微切的呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA中可检测到正常的白蛋白基因序列。(4)组Ⅳ和组Ⅴ血清中白蛋白水平显著升高。结论F344来源的肝非实质细胞能驻存于γ射线全身照射的F344alb的骨髓,进而在肝内转化为产白蛋白肝细胞。     

大鼠2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中卵圆细胞增殖动力学的初步研究

目的 研究大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型中卵圆细胞增殖率的变化,进一步了解卵圆细胞生物学特性.方法 采用2-乙酰胺基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)的方法建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型.免疫荧光双标技术检测肝切除术后不同时间点肝脏石蜡切片中卵圆细胞标志物上皮细胞黏附分子和增殖标志物增殖细胞核抗原的共表达情况,对阳性细胞进行定量计数分析;并采用荧光双标和天狼猩红染色观察此过程中肝星状细胞激活和肝脏胶原沉积的情况.结果 术后第2天门静脉区开始出现少量卵圆细胞,到第9天数量达到高峰,此后数量逐步下降.此过程中卵圆细胞的增殖率逐步下降,从第2天的(91.3±1.6)%下降到第12天的(53.6±4.4)%,差异有统计学意义(P＜0.01).激活的肝星状细胞一直伴随卵圆细胞增殖并向肝实质延伸,分泌的胶原形成细胞外基质包绕小管样结构的卵圆细胞.结论 2-AAF/PH模型中卵圆细胞数量达到高峰前,其增殖率已经开始逐渐下降.肝星状细胞可能通过分泌细胞外基质和多种因子严格调控卵圆细胞的增殖.     

微囊化胰岛细胞异种移植治疗小鼠糖尿病

我们进行空囊移植及胰岛、微囊化胰岛的异种移植 ,以期寻找影响胰岛存活的原因 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1 .糖尿病小鼠的制备 :链脲菌素溶于枸橼酸钠溶液中 ( ｐＨ4.5)制成浓度1 0 ｇ/Ｌ溶液 ,2 2 0ｍｇ/ｋｇ体重小鼠腹腔注入。非空腹血糖连续 2次超过 3.5ｇ/Ｌ则定为已患糖尿病。剪尾以便携式血糖仪测定尾静脉血糖。2 .胰岛细胞的分离和纯化 :胰岛细胞的分离见文献 [1 ]。胰岛细胞纯化 :Ｆｉｃｏｌｌ离心。消化沉淀物和 2 5%Ｆｉｃｏｌｌ溶液混匀 ,其上依次加入 2 3.0 %、2 0 .5%、1 1 .0 %Ｆｉｃｏｌｌ各 2ｍｌ,80 0 ｇ离心 1 5…     

端粒酶在大鼠肝卵圆细胞中表达的意义

目的 检测大鼠肝卵圆细胞端粒酶活性,探讨端粒酶表达与卵圆细胞增殖分化的关系.方法 采用2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,改良的胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离,用细胞免疫荧光和电镜鉴定卵圆细胞.采用免疫组织化学、RT-PCR、荧光定量PCR等方法检测卵圆细胞端粒酶的表达,组间比较采用t检验分析其意义.结果 采用2-AAF/PH模型成功诱导大鼠卵圆细胞增殖.分离的卵圆细胞核大,卵圆形,胞质少,呈铺路石样生长.电镜发现细胞核质比大,胞质内细胞器少且发育不成熟.细胞免疫荧光结果表达OV-6、AFP、CK-19、albumin、c-kit.端粒酶逆转录酶(TERT)表达在门静脉周围增殖的卵圆细胞核内,随着卵圆细胞逐渐向肝细胞方向分化,TERT阳性细胞数逐渐减少.大鼠正常肝组织TERT mRNA表达水平最高,为LE-6卵圆细胞的2.27倍;分离的卵圆细胞TERT mRNA表达水平为LE.6卵圆细胞的1.26倍;采用2μg和4μg细胞提取物分析细胞的端粒酶活性,随着LE-6卵圆细胞传代次数的增加,由24代传至40代,端粒酶活性由△A=1.05、1.15降低到△A=0.25、0.45(t=17.74,12.38,P<0.05).结论 卵圆细胞具有端粒酶活性,端粒酶可能是卵圆细胞维持其增殖能力和多分化潜能的一个必要条件.     

利用特异性Y染色体研究肝脏卵圆细胞在原发性肝癌发生中的作用

目的利用Y染色体细胞的特异性来研究肝脏卵圆细胞分化为肝癌细胞的直接证据,从而为卵圆细胞源性的研究及将来卵圆细胞的临床应用提供理论依据。方法30只雄性Wistar大鼠喂含0．06％的3-甲基4-二甲基偶氮苯（DAB）的饲料4周,建立动物模型。将雌性Wistar大鼠40只随机平分成对照组和实验组,对照组不接种提取的雄性Wistar大鼠卵圆细胞悬液,连续喂含DAB的饲料14周。实验组肝脏包膜下接种悬液,连续喂DAB饲料14周,以促进肝肿瘤的生成。设计引物片断,14周后提取两组大鼠肝肿瘤组织的基因组DNA,应用PCR扩增,对产物进行电泳分析。结果14周后40只雌性大鼠均见肝脏肿瘤生成,实验组电泳后均见与设计片断长度相符的电泳阳性条带,对照组则未见阳性条带。结论大鼠的卵圆细胞可分化为肝癌细胞,为卵圆细胞源性肝癌细胞的假说提供实验依据。     

胶原凝胶包埋肝细胞体外培养和腹腔移植的研究

目的　研究改进肝细胞腹腔移植的方法。方法　用胶原凝胶包埋大鼠肝细胞 ,并在体外培养 ,测定培养液中总蛋白 (TP)和尿素氮 (BUN)水平。将胶原培养液与鼠肝细胞混合后注入大鼠腹腔 ,混合物在腹腔内形成凝胶并包埋肝细胞。用含酶的培养液将受者鼠腹腔内的移植肝细胞洗出 ,再置于无葡萄糖培养液中培养 ,测定培养液中葡萄糖含量。对照组处理过程与实验组相同 ,但不用胶原。结果　胶原凝胶包埋肝细胞组的TP、BUN和葡萄糖含量均明显高于对照组 (P <0 .0 1)。胶原培养液与肝细胞混合物在注入腹腔 2 4h后变为凝胶。结论　胶原凝胶可促进体外培养或腹腔移植的肝细胞生长 ;胶原培养液腹腔注射和腹腔内胶原凝胶包埋细胞法 ,使肝细胞的腹腔移植更简便、安全、实用。     

大鼠肝卵圆细胞中matrilin-2的表达及其意义

目的探讨大鼠肝脏再生过程中肝卵圆细胞matrilin-2的表达及其意义。方法利用大鼠部分肝切除(PH)或2-乙酰氨基芴灌胃+/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝脏再生模型,并设正常对照组。应用免疫组织化学和RT-PCR方法研究肝脏组织中matrilin-2表达情况。结果免疫组化发现正常对照组及PH组肝脏组织中只有极少量的matrilin-2表达位于胆管血管周围及肝窦状隙内,而在2-AAF/PH模型中可见matrilin-2表达位于门静脉周围的肝窦状隙内,RT-PCR发现2-AAF/PH组肝卵圆细胞中matrilin-2mRNA高表达,而PH组及正常对照组成熟肝细胞中无matrilin-2mRNA表达。结论matrilin-2是肝卵圆细胞在肝脏再生过程中产生的重要的细胞外基质蛋白,与肝卵圆细胞的增殖分化过程有密切关系。