淫羊藿苷可促进人成骨细胞增殖与分化

北京大学第三医院科研人员在观察淫羊藿苷对人成骨细胞增殖和分化的影响时发现，淫羊藿苷具有促进人成骨细胞增殖和分化的作用，这一作用可能与其升高人成骨细胞BMP-2mRNA的表达有关。     

淫羊藿苷对前成骨细胞株OCT1细胞BMP-2 mRNA、Runx-2 mRNA表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对成骨细胞增殖和分化的影响及作用机制。方法常规培养前期实验建立的前成骨细胞株OCT-1细胞(OCT1细胞),采用淫羊藿苷进行干预48 h,浓度分别为10 mg/L、30 mg/L及60 mg/L,并以BMP2纯化蛋白(50μg/L)为阳性对照。利用MTT法检测成骨细胞增殖率,实时荧光定量RT-PCR检测成骨细胞中BMP2 mRNA、Runx2 mRNA的表达。结果与正常对照组比较,淫羊藿苷能明显促进成骨细胞的增殖(P0.05);淫羊藿苷可显著提高成骨细胞中BMP2 mRNA、Runx2 mRNA表达量(P0.05)。结论淫羊藿苷通过激活前成骨细胞中BMP信号通路上调Runx2的表达,从而诱导成骨细胞的增殖和分化。     

淫羊藿总黄酮对大鼠成骨细胞代谢调控的机制研究

目的：探讨淫羊藿总黄酮对大鼠成骨细胞代谢调控的影响。方法:取新生SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞。应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法(PNPP)和RT-PCR方法观察淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和OPG mRNA,RANKL mRNA表达的影响。结果:淫羊藿总黄酮能刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,增强OPG mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）。结论:淫羊藿总黄酮能促进成骨细胞的增殖、分化,增加OPG mRNA的表达,对RANKL的表达无明显影响。     

淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样作用研究

目的:用雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)表达阳性细胞株人乳腺癌细胞MCF-7检测淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样活性[1]及构效关系。方法:用MTT法,增殖细胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen,PCNA)免疫组化法检测其对体外培养MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响;Real-timeRT-PCR法检测ERα、ERβ和PS2 mRNA表达水平变化。结果:淫羊藿素促进MCF-7增殖,而淫羊藿苷、淫羊藿次苷I和脱水淫羊藿素促增殖效应不明显;淫羊藿素10-9mol.L-1组PCNA阳性表达强于其它三组;淫羊藿素极显著增加ERα和PS2 mRNA的表达水平。所有受试物均不促进ERβmRNA表达。淫羊藿素促进ERα蛋白表达强于其它三组。结论:淫羊藿素有明显的雌激素样作用,而淫羊藿苷及其它两种受试物雌激素样作用不明显。四种受试物均不促进ERβmRNA表达。     

三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍对成骨细胞的增殖和钙化作用研究

目的:探讨三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍对体外培养成骨细胞的增殖和钙化的影响.方法:取3～5代成骨细胞进行试验,成骨细胞密度为1×105个/mL,三七总皂苷和淫羊藿苷质量浓度为1,10,20,50 mg·L-1,采用MTT法观察单个药物及其配伍对成骨细胞的增殖的影响,采用茜素红钙化结节染色法观察钙化作用.结果:三七总皂苷和淫羊藿苷在质量浓度为10,20,50 mg·L-1时皆能够明显促进成骨细胞增殖.三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍比例为5∶2时,可明显促进成骨细胞增殖并有明显的钙化作用(P＜0.01).结论:从对成骨细胞增殖和钙化作用的角度证实了三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍的合理性.     

淫羊藿苷对人成骨细胞的作用

为探讨淫羊藿苷对人成骨细胞的影响,采用分次酶消化法做离体人成骨细胞培养,得到性状稳定、纯度高的成骨细胞;用MTT法做淫羊藿苷对成骨细胞增殖的研究。结果发现不同浓度的淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖均有促进作用,以10ng·ml-1浓度时其作用最强(P<0.05);生化方法测定淫羊藿苷浓度为100ng·ml-1和10ng·ml-1对成骨细胞分泌碱性磷酸酶(AKP)有促进作用。表明淫羊藿苷促进成骨细胞增殖的同时,增强了成骨细胞成骨活性。     

5种淫羊藿黄酮类成分对体外培养成骨细胞的影响

目的：观察5种淫羊藿黄酮——淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿定B、淫羊藿定C对体外培养成骨细胞增殖、细胞基质钙及矿化结节钙的影响。方法：取新生1～3dSD大鼠头盖骨用酶消化法分离成骨细胞，第3代细胞经MTT法、甲基百里香酚蓝(MTB)比色法观察5种黄酮对体外培养成骨细胞增殖、细胞基质钙及矿化结节钙的影响。结果：淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿定C0．1—10μmol／L浓度均能显著地促进成骨细胞增殖，淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿定B0．1—10tanol／L浓度均能显著增加细胞基质钙,淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿定B0．1～10pmol／L浓度、淫羊藿苷lpmol／L浓度及淫羊藿定C0．1～1pmol／L浓度均能显著增加矿化结节钙。结论：淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿定B、淫羊藿定C具有增加细胞基质钙及促进体外培养成骨细胞增殖和矿化的作用。     

补肾健骨类中药活性成分对高糖诱导成骨细胞的保护作用及机制研究

目的:探讨柚皮苷、补骨脂二氢黄酮、淫羊藿苷等3种补肾健骨类中药活性成分对高糖诱导成骨细胞的保护作用和机制。方法:建立高糖诱导成骨细胞模型;实验设正常对照组、模型组(30mmol/L葡萄糖)和给药组。给药组为分别在模型细胞中加入补骨脂二氢黄酮组、柚皮苷组和淫羊藿苷。作用48h后,观察细胞形态,MTT法检测成骨细胞活性,RT-PCR检测成骨细胞中胰岛素受体底物(IRS1)、AKT、Runx2的mRNA表达,Western Blot法检测各组细胞IRS1、AKT、Runx2蛋白的表达。结果:高糖(5.4mg/ml)诱导的成骨细胞,48h后细胞存活率较正常组显著下降(P0.05)。与模型组相比,淫羊藿苷组给药后48h,细胞存活率显著上升(P0.05)。柚皮苷、补骨脂二氢黄酮、淫羊藿苷给药后,AKT、IRS1、Runx2的mRNA表达上升(P0.05),AKT、IRS1、Runx2蛋白表达上升(P0.05)。结论:柚皮苷、补骨脂二氢黄酮和淫羊藿苷对高糖诱导的成骨细胞具有保护作用,促进其增殖,作用机制可能与调控成骨细胞ISR1/AKT/Runx2信号通路有关。     

淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原表达和BGP影响的实验研究

目的:研究淫羊藿甙对体外培养的大鼠成骨细胞功能的影响,探讨淫羊藿甙促进成骨的细胞及分子机制。方法:实验分组将不同浓度的淫羊藿甙加入到其中进行共培养,其对于成骨细胞增殖和分化的影响通过MTT比色实验、BGP含量的放免法检测以及用荧光二抗的免疫组化实验测定Ⅰ型胶原的表达来进行。结果:淫羊藿甙能促进成骨细胞Ⅰ型胶原的表达和BGP的合成。结论:淫羊藿甙具有刺激体外培养成骨细胞增殖、分化和矿化的功能。     

淫羊藿苷对骨髓间充质成骨性活性强于金雀异黄酮

目的:比较研究金雀异黄酮与淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞(rats bone marrow stromal cell,rBMSC)成骨性分化的影响.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质细胞,筛选最佳的药物浓度;采用终浓度为1×10-5mol·L-1的金雀异黄酮和淫羊藿苷对体外培养原代大鼠骨髓间充质细胞进行干预;在药物干预后的第3,6,9,12,15天后测定碱性磷酸酶活性(alkaline pbosphatase,ALP)和3,6,9,12,15 d测定钙含量;第12天进行钙化结节茜素红染色;在药物干预后第12,24,48,72,96 h Real-time RT-PCR检测OXS,Runx-2,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP-2)和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平.结果:浓度为1 ×10-5 mol·L-1金雀异黄酮和淫羊藿苷可提高ALP活性最高,增加Ca含量,调节骨代谢活性Runx-2,OXS,BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA的表达水平,淫羊藿苷比金雀异黄酮的成骨性作用更强一些.结论:在促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化作用方面淫羊藿苷较强于金雀异黄酮.     

生骨注射液对大鼠成骨细胞BMP-2 mRNA表达影响的实验研究

目的:研究生骨注射液对体外培养的大鼠成骨细胞BMP-2mRNA表达的影响,探讨生骨注射液促进骨折愈合的分子机制.方法:体外培养大鼠成骨细胞,分别给予不同浓度、时间的生骨注射液进行干预实验,然后用RT-PCR技术分别检测各组细胞BMP-2 mRNA的表达,并进行定量分析.结果:在不同浓度时,生骨注射液连续干预至第5 d,以1 mg/ml浓度条件下,BMP-2 mRNA表达最强;而以1 mg/ml生骨注射液干预1～5 d,BMP-2 mRNA的表达随时间逐渐增强.结论:生骨注射液对体外培养的大鼠成骨细胞BMP-2 mRNA表达有明显促进作用,其作用强度随浓度、时间而改变.     

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。     

益骨胶囊含药血清对晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化及BMP-2和OPG的影响

目的研究益骨胶囊含药血清对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)作用下成骨细胞分化活性及对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)和骨保护蛋白(osteopro-tegerin,OPG)的影响,探讨益骨胶囊防治骨质疏松(osteoporosis,OP)的作用机制。方法选取10月龄SD雌性大鼠40只,随机分为益骨胶囊高、中、低剂量组及空白组,每组10只。运用大鼠灌胃的方法制备含药血清和对照血清。二次酶消化法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,传代后分为空白对照组、模型组、中药低、中、高剂量组。模型组用AGEs(400mg/L)处理,中药低、中、高剂量组分别用AGEs(400mg/L)和低、中、高剂量含药血清共同处理,分别用pNPP、ELISA、茜素红染色法检测成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,ColⅠ)、骨钙素(bone gla protein,BGP)以及矿化结节,RT-PCR测定成骨细胞中BMP-2、OPG mRNA的表达,ELISA法检测BMP-2、OPG蛋白的表达量。结果原代分离培养的新生大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞特征;与空白对照组比较,模型组成骨细胞(OB)ALP、ColⅠ、BGP、BMP-2、OPG蛋白及BMP-2、OPG mRNA表达降低,矿化结节减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,中药各剂量组ALP、ColⅠ、BGP、BMP-2、OPG蛋白及BMP-2、OPG mRNA表达升高,矿化结节增加,且随剂量增加而明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论益骨胶囊含药血清提高AGEs作用下成骨细胞分化和矿化能力,提高BMP-2、OPG的表达,这可能是益骨胶囊防治OP的机制之一。     

补肾益骨方对去势大鼠成骨细胞增殖及BMP-2表达的影响

目的:观察补肾益骨方对去势大鼠成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响。方法:取12周龄Wistar雌性大鼠40只,随机分为A(模型组)、B(治疗组)、C(阳性对照组)、D(正常对照组)四组,每组10只,前3组行完整双侧卵巢摘除术,D组行假手术,术后常规饲养12周,再分别予以生理盐水、补肾益骨方水提液、α-D3水溶液及生理盐水灌胃治疗12周,处死大鼠,取右胫骨上端做病理切片,通过HE染色观察成骨细胞增殖、免疫组化染色观察BMP-2表达。结果:治疗组成骨细胞数量明显增加,而且通过免疫组化染色发现BMP-2棕色深染的阳性细胞比例明显高于模型组。结论:补肾益骨方能促进成骨细胞分化、增殖,加速骨形成,具有治疗骨质疏松的作用。推测骨中BMP-2含量增加是其重要的治疗机理之一。     

菟丝子含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制

目的:探讨菟丝子含药血清体外对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响及机制研究。方法:分离、培养大鼠MSCs,菟丝子含药血清诱导培养MSCs 72h后,MTT法检测大鼠MSCs增殖情况;RT-PCR检测增殖过程中MSCs不同细胞因子mRNA的表达;Real-time PCR检测骨形态蛋白-2(BMP-2)mRNA表达;Western-blot检测BMP-2蛋白表达。结果:10%菟丝子含药血清具有显著促进MSCs增殖的作用(P<0.05),并显著促进BMP-2 mRNA的表达(P<0.05)。结论:10%菟丝子含药血清促进MSCs增殖的作用,可能与其促进BMP-2 mRNA表达有关。     

不同剂量健腰密骨片对骨形成和小鼠骨髓间充质干细胞中BMP-7表达的影响

目的探讨不同剂量健腰密骨片对小鼠椎体和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨分化过程中骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)表达的影响。方法选取1月龄昆明小鼠48只,雌雄各半,按体质量随机分为健腰密骨片高、中、低剂量组及生理盐水4组,灌胃8周后取材。用Micro-CT扫描分析L4腰椎,免疫组化染色观察不同剂量健腰密骨片对椎体BMP-7表达的影响;分离培养获得各组小鼠原代骨髓间充质干细胞(BMSCs),利用碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量RT-PCR法检测BMSCs成骨分化过程中BMP-7的表达情况。结果与生理盐水组比较,健腰密骨片高剂量组能够改善小鼠椎体三维结构,促进椎体BMP-7蛋白的表达;健腰密骨片高剂量组能够明显增加BMSCs中ALP活性,上调成骨基因BMP-7 mRNA的表达量(P0.05)。结论健腰密骨片高剂量组能够明显提高小鼠椎体骨量,促进BMSCs成骨分化,上调椎体和BMSCs成骨分化过程中BMP-7表达,从而促进骨形成。     

茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因表达的影响

目的:观察茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因ALK、COL1A1、RUNX2、BMP-2表达的影响.方法:培养人骨髓基质干细胞,用浓度为10-5M、10-6M茶多酚EGCG以及空白对照组分别作用人骨髓基质干细胞21 d后,采用荧光定量PCR的方法检测成骨相关基因ALK、COL1A1、RUNX2、BMP-2的表达变化.结果:BMP-2基因的表达水平为:10-5M茶多酚组>10-6M茶多酚组>DMSO对照组;ALK、RUNX2、COL1A1基因在茶多酚EGCG组与空白对照组之间表达无明显变化.结论:茶多酚EGCG可以提高人骨髓基质干细胞BMP-2基因的表达水平,有可能是茶多酚促进人骨髓基质干细胞成骨分化的重要基因.     

薯蓣皂苷元对大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的:研究薯蓣皂苷元对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化及护骨素/核因子κB受体活化因子配基(OPG/RANKL) mRNA的影响,探讨薯蓣皂苷元预防与治疗骨质疏松的作用机制。方法:在体外培养的大鼠成骨细胞培养基中分别加入不同浓度的薯蓣皂苷元作用不同时间,用MTT法检测药物对成骨细胞增殖的影响,检测成骨细胞内ALP活性分析药物对成骨细胞分化的影响,用半定量RT-PCR检测成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的表达量,分析药物对破骨细胞重要信号传导通路OPG/RANKL/RANK系统的影响。结果:3.64×10-8-3.64×10-7mol/L的薯蓣皂苷元作用于大鼠成骨细胞3d,可促进成骨细胞的增殖(P<0.01),上调成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的比值(P<0.01);作用7d,可提高成骨细胞内ALP活性(P<0.05或P<0.01)。结论:适量浓度薯蓣皂苷元可促进成骨细胞的增殖、分化及抑制破骨细胞的形成。     

戴村骨伤膏对人成骨样细胞(MG-63细胞)增殖及BMP-2表达的影响

目的:为了研究戴村骨伤膏对骨折愈合的影响,我们将其运用于人成骨样细胞(MG-63细胞)体外的细胞试验,观察其对细胞增殖及BMP-2表达的影响。方法:在体外培养的MG-63细胞中,加入不同浓度的戴村骨伤膏药物溶液作用后,使用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖以及RT-PCR反应法检测细胞中BMP-2表达情况。结果:戴村骨伤膏药在早期能较明显的促进成骨细胞MG-63的增殖分化及BMP-2的表达,并且效果随着药物浓度的升高而增强,但是随着时间延长药物对MG-63细胞增殖反而起抑制作用。结论:说明戴村骨伤膏对MG-63细胞增殖具有促进和抑制双重效应,其效应强度随作用时间不同而不同。