SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究

目的探讨制备和鉴定SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体(mAb)快速免疫方法。方法用基因重组SARS冠状病毒N蛋白和足垫免疫2周的BALB/c小鼠制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株抗SARS冠状病毒N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法和免疫荧光证实这组单克隆抗体仅与SARS冠状病毒特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG亚类鉴定2株为IgG1,另2株分别IgG2a和IgG2b。2株抗体亲和常数分别为4.14×10-9 M和3.19×10-9 M。结论获得特异性针对SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断、蛋白组学和发病机制的研究奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

泰泽病原体单克隆抗体的制备和鉴定

目的　制备多种抗泰泽病原体的单克隆抗体 ,用于该菌隐性感染的检测。方法　用含泰泽病原体的大鼠肝匀浆免疫BALB c小鼠 ,采用杂交瘤技术和间接免疫荧光方法筛选抗该菌的单克隆抗体 ;运用免疫电镜、Westernblotting和免疫双向扩散试验确定单克隆抗体的抗原定位和相对分子质量及IgG亚类型。结果　共筛选出 5种单克隆抗体 (M2、M3、M4、M5和M7)。免疫电镜表明 :抗体M2、M4、M5、和M7与泰泽病原体的细胞壁结合 ,而M3为抗菌毛的单克隆抗体 ;Westernblotting结果表明 :抗体M2、M3和M4与相对分子质量约为 6 4× 10 3的抗原有特异性结合 ,M5与M7与相对分子质量约为 4 1× 10 3的抗原特异性结合 ;M2、M5、M7为IgG1 ,M3为IgG2b,M4为IgG2a。对模拟自然感染大鼠考的松激发试验阳性为 2 10 ,而单克隆抗体为诊断抗体的IFA则为 8 10。除M7外 ,4种单抗不与清洁级以上大鼠回盲部细菌发生反应。结论　筛选的杂交瘤细胞能稳定分泌抗体 ,其IFA效价达 1∶10 2 4 ;表明这些抗体具有高效价、较高特异性和敏感性。     

肺炎支原体种特异性单克隆抗体杂交瘤制备及鉴定

目的　制备抗肺炎支原体种特异性单克隆抗体。方法　以纯化的肺炎支原体膜蛋白抗原 (相对分子质量为43× 10 3)加福氏免疫佐剂免疫 8周龄雌性BALB c小鼠 ,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 0 Ag14融合 ,以酶标记免疫吸附测定法 (ELISA)筛选和鉴定所制备的单克隆抗体。结果　共筛出 3株分泌抗肺炎支原体种特异单克隆抗体杂交瘤 ,经免疫鉴定其分泌的免疫球蛋白类型为IgG1、IgG2a及IgM ,与肺炎支原体有很强的亲和力 ,与种属相近的其它 6株支原体没有交叉反应。结论　本次筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌高浓度的肺炎支原体单克隆抗体 ,并且有很强的种特异性。     

抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备

目的 制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体(McAbs).方法 用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合.以酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体.结果 经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价最高达1.4×105以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgC2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株(A～F)与胆汁螺杆菌大约相对分子质量(17、20、21、30、52、66)×103的抗原特异结合,5株(G～K)皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量(52、82)×103的抗原呈阳性反应,表明A～F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G～K株可能具有属特异性.结论 筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础.     

抗小鼠endolgin单克隆抗体杂交瘤的建立和初步应用

目的 建立能够分泌特异性抗小鼠endogun的单克隆抗体杂交瘤细胞系，为深入研究endoglin的新功能、诊断和治疗肿瘤血管生成提供物质基础。方法 利用小鼠endc，glin胞外段重组蛋白作为抗原免疫大鼠，通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠endoglin单克隆抗体的杂交瘤系。利用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型，免疫印迹方法明确筛选的单克隆抗体的特异性，免疫组化和免疫荧光初步判定获得的单克隆抗体是否可以应用于临床诊断。结果通过对90多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选，获得一株分泌特异性抗小鼠endoglin的单克隆抗体杂交瘤细胞系，分泌的单克隆抗体亚型为IgG1，轻链亚型为kappa。免疫印迹显示该研究获得的单克隆抗体可以特异识别小鼠endoglin重组蛋白，该单克隆抗体可以结合实体肿瘤组织微血管上的特异抗原并将微血管有效染色。结论本研究所获得的抗小鼠endglin单克隆抗体将有助于深入研究endoglin的新功能，为肿瘤血管生成的诊断和治疗提供了物质保障。     

人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。     

抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体细胞系的建立及鉴定

目的 初步建立抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体规模化制备技术平台,为制备抗人细胞色素P450(CYP450)亚型蛋白的单克隆抗体奠定基础.方法 按常规方法进行细胞融合,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选杂交瘤,以ELISA、免疫组化(HI)、免疫印迹(Western Blot)、免疫沉淀(IP)对单克隆抗体加以鉴定.结果 进行6次融合,共筛出216株杂交瘤,其分泌抗体类型为IgG1、IgG2a、IgG2b、及IgM.免疫组化(IH)图片上,人肝细胞浆内均可见阳性颗粒.免疫沉淀(IP)和免疫印迹(Western Blot)结果显示,所制备抗体与人肝微粒体蛋白有特异性结合.结论 筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体,并且有较强特异性,为下一步研究提供了基础与技术平台.     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的 观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法 应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoVN蛋白。结果 肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞／巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoVN蛋白单克隆抗体均为阳性。结论 SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoVN蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达，对研究SARS—CoV传播途径具有重要意义。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究

OBJECTIVE: To develop a rapid and efficient method for preparing monoclonal antibodies (mAb) against SARS-associated coronavirus (SARS-Cov) nucleocapsid (N) protein. METHODS: BALB/c mice were injected with the recombinant N protein of SARS-Cov into the foot-pads for the immunization, and the popliteal lymph nodes were isolated 15 d later for mAb-producing hybridomas, from which the mAbs against the N protein of SARS-Cov were screened. The identification of the mAb against the N protein of SARS-Cov was performed using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), indirect fluorescent-antibody assay (IFA), and Western immunoblotting. RESULTS: Four strains of hybridomas were obtained that produced the mAb specific to the N protein without detectable cross-reactivity with other pathogens. Of the 4 strains, 2 were identified as the immunoglobulin G1 (IgG1) isotype, 1 IgG2a, and the other IgG2b, with affinity constants (Ka) of 2 of the strains being 4.14 x 10(-9)M and 3.19 x 10(-9)M respectively. CONCLUSION: This is the first report on the preparation of mAb that is specific to the SARS-Cov, and the high-specificity and high-affinity mAb produced by the 4 strains of hybridomas provide a basis for further researches on the pathogenesis and early diagnosis of SARS.     

鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,探讨X4蛋白的结构和功能,以及临床应用的价值.方法:以重组SARS病毒X4蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合, 通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫荧光实验等方法鉴定其特性.结果:成功地建立了3株稳定分泌抗X4蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A5,8H6和4A2.3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG2a.通过ELISA, Western blot等方法的鉴定,抗X4蛋白的单克隆抗体能与X4蛋白发生特异性反应.免疫荧光实验的结果表明,X4蛋白的单克隆抗体能与SARS-病毒感染的Vero E6 细胞发生特异性结合.结论:获得了特异性识别SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,为SARS病毒X4蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

Preparation and identification of monoclonal antibodies against Penicillium marneffei]

OBJECTIVE: To prepare and identify monoclonal antibodies (mAbs) against Penicillium marneffei. METHODS: Recombinant mannoprotein1 (MP1) of Penicillium marneffei was used to immunize BALB/c mice, and anti-MP1 mAbs were obtained by means of hybridoma. Screening and identification of the mAbs were subsequently performed with indirect enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting, respectively. RESULTS: Four hybridomas producing antibodies against Penicillium marneffei were obtained, and the IgG isotypes of the 4 mAbs were identified as IgG1 with affinity constants (K) of 8.2x10(-9), 4.7x10(-9), 6.5x10(-9) and 2.7x10(-9), respectively. Western blotting demonstrated specific recognition of Aspergillus fumigatus MP1 by the obtained mAbs. CONCLUSION: The 4 hybridomas producing anti-MP1 mAbs with high specificity and affinity can be of significant value in the diagnosis of Penicilliosis marneffei infections.     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

Evaluation by indirect immunofluorescent assay and enzyme linked immunosorbent assay of the dynamic changes of serum antibody responses against severe acute respiratory syndrome coronavirus

Background Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is a newly emerging virus that gives rise to SARS patients with high rates of infectivity and fatality. To study the humoral immune responses to SARSCoV, the authors evaluated lgG and IgM specific antibodies in patients‘ sera.Methods Two methods, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescent assay (IFA) , were used to detect specific serum IgG and IgM against SARS-CoV in 98 SARS patients and 250 controls consisting of patients with pneumonia, heahh-care professionals and healthy subjects. The serum antibody profiles were investigated at different times over one and a half years in 18 of the SARS patients.Results The sensitivity and specificity of ELISA for detecting IgG against SARS-CoV were 100.0% and 97.2% and for IgM 89. 8% and 97.6% respectively; the figures using IFA for IgG were 100.0% and 100.0% and for IgM 81.8% and 100.0% respectively. During the first seven days of the antibodies trace test, no IgG and IgM were detected, but on day 15, IgG response increased dramatically, reaching a peak on day 60,remaining high up to day 180 and decreasing gradually until day 540. On day 15,IgM was detected, rapidly reached a peak, then declined gradually until day 180 when IgM was undetectable.Conclusion The detection of antibodies against SARS virus is helpful in the clinical diagnosis of SARS.     

SARS流行期间高暴露医护人员SARS病毒抗体检测分析

目的探讨在2003年SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)流行期间,曾经参加救治SARS病例的医护人员(高暴露人群)SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体产生情况,为防范SARS提供指导意义。方法运用酶联免疫(ELISA)方法,同时检测95例SARS患者、313例高暴露人群和90例正常对照组血清SARS病毒抗体,包括IgM和IgG。结果95例临床确诊的SARS患者IgM抗体总阳性率为91.6%,IgG抗体总阳性率为97.9%,所有高暴露人群和正常对照组抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG均为阴性。结论对SARS流行期间不同人群SARS病毒血清抗体检测表明,313名医护人员和90名正常健康人中,未发现隐性感染者,SARS病毒抗体检测,可以为临床诊断、预防和流行病学调查等提供指导意义。