骨髓间质干细胞绿色荧光蛋白基因的转染和克隆化研究

目的 建立能稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)并连续传代培养的骨髓间质干细胞(MSCs)株。方法 采用电穿孔法将带有GFP的质粒(pGFP-N1)在不同条件下转染MSCs,经过G418筛选,有限稀释法筛选阳性克隆,荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达情况。结果 电穿孔以电容量1050μF、电压260V时效果最好,转染GFP的MSCs能在含有G418的培养基中生长,未转染的骨髓间质干细胞不断死亡。转染24h后即能观察到少量荧光细胞,一个月后大部分荧光细胞呈集落样生长,荧光表达较强,转染率为50％-60％。体外克隆后,能稳定表达至10代,10代后荧光强度明显减弱。结论 GFP基因能在MSCs中进行有效的复制、转录和翻译,并可持续、稳定、高效表达;转染GFP的MSCs能作为研究MSCs的诱导分化及生物细胞工程治疗的载体细胞。     

绿色荧光蛋白报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达:用做转染报道基因的可行性鉴定

目的:将经过"人类化"改造的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因质粒导入鼻咽癌CNE1细胞系内,观察GFP报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达情况.方法:实验于2004-07/2007-07在广东医学院病理学实验室完成.将带有GFP报道基因的质粒PAT-GFP及PAT-GFP-LMP1在电容960 μ F,280 V条件下电导转染到鼻咽癌CNE1细胞系中,用选择培养液(嘌呤霉素筛选)继续换液培养直至长出抗性细胞克隆,胰酶消化收集细胞.存488 nm光激发下,用荧光显微镜检测及流式细胞仪观察转染细胞在活的、固定后或裸鼠体内移植后3组细胞的GFP的表达情况并计算转染效率,并用免疫组化法及Western blot法观察插入目的基因LMP1的表达情况.结果:温度在28～32℃的条件下活细胞有GFP基因稳定而持续地表达,但表达较低,表达率为(16.20±1.70)%,且目的基因LMP1的插入明显影响GFP基因的表达,表达率为(3.48±0.28)%,而在固定后或裸小鼠体内移植后均无表达;目的基因LMP1则能稳定而持续地表达.结论:绿色荧光蛋白报道基因GFP在CNE1细胞系中能稳定而持续地表达,且不影响插入目的基因的表达,可用做转染报道基因.     

GFP和HSV—TK基因在四种细胞株中的共表达

目的：研究新型报道基因——绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和目的基因HSV-TK基因在哺乳动物细胞内的表达。方法：将同时表达GFP和HSV-TK的多右反子重组逆转录病毒GCGPTKSN，分别转染K562、NS-1、EL4、Sp2/0细胞株，并在体外应用荧光显微镜检测GFP的表达，同时GCV杀伤试验检测HSV-TK基因表达。结果：GFP在四种细胞系中高效表达。高浓度的GCV能有效抑制转染细胞的生长。结论：逆转录病毒载体能介导GFP和HSV-TK基因进入多种细胞系，并在那里共表达。GFP基因是一种很有前途的报道基因，这为基因转移的检测以及转基因细胞的筛选提供了一种新的方法。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉:最佳在体表达时间点的确定

背景:重组9型腺相关病毒载体对心肌组织具有较高的亲和力,关于携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein,r AAV9-e GFP)在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉中的表达情况还不确定。目的:探索携带r AAV9-e GFP转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉最佳的在体表达时间点。方法:给予30只Apo E-/-小鼠连续高脂饮食饲养16周建立为动脉粥样硬化模型,然后随机取其中25只通过尾静脉注射转染5.0×1011 vg(virus genomes)r AAV9-e GFP,另5只作为对照组给予生理盐水。转染病毒的动脉粥样硬化模型小鼠分别于转染后14,21,28,35,60 d处死,留取主动脉组织,应用激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白荧光表达情况,Western blot法检测主动脉增强型绿色荧光蛋白的蛋白表达,观察增强型绿色荧光蛋白体内表达情况,确定病毒在体表达最佳时间点。结果与结论:r AAV9-e GFP可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管,增强型绿色荧光蛋白可在主动脉组织中表达,其表达强度随着转染时间的增加而逐渐增强,于转染35 d时表达最强,60 d趋于稳定,各时间点主动脉斑块中增强型绿色荧光蛋白表达的水平差异有显著意义(P<0.001)。表明r AAV9-e GFP可有效在动脉粥样硬化模型Apo E-/-小鼠主动脉中表达,r AAV9-e GFP可成为动脉粥样硬化治疗的最佳载体。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

携带绿色荧光蛋白基因慢病毒转染的大鼠骨髓间充质干细胞的干细胞特性检测

目的:研究携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒转染的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是否仍具有干细胞的特性。方法:培养大鼠骨髓MSC,采用携带GFP基因的慢病毒转染MSC。用不同感染复数(multiplicity of infection,MOI,分别设定为5、10、25、50)转染MSC,在荧光显微镜下观察转染效果,流式细胞仪测定最佳MOI的转染效率和携带GFP的MSC(MSC-GFP)表面抗原CD表型,采用成脂肪、成骨、成软骨分化液诱导MSC-GFP分化,荧光显微镜和化学染色观察诱导分化结果。结果:MOI=25时细胞死亡少,转染效果最佳,转染效率为97%。MSC-GFP不表达CD11b/c(2%)、CD45(3%),表达CD29(100%)、CD90(99%),可向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化,符合干细胞特性。结论:携带GFP基因的慢病毒转染的骨髓MSC维持着干细胞特性。本研究结果为MSC在体内示踪研究提供理论基础。     

超声微泡造影剂介导小鼠骨骼肌基因转染实验研究

目的探讨微泡造影剂在超声作用下是否可增加小鼠骨骼肌基因转染效率.方法 40只昆明小鼠随机分为4组,每组10只,第一组:在胫前肌注射造影剂与绿色荧光蛋白(GFP)质粒的混合溶液;第二组:注射与第一组相同的混合溶液后立即加超声辐照;第三组:注射GFP;第四组:在注射GFP后立即用超声辐照.7天后取小鼠胫前肌观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果第一组与第二组有较多GFP表达,部分肌纤维绿色荧光较明亮,部分较暗淡;第三组和第四组GFP表达量较少.第一组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第二组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第三组与第四组间的差异无显著性意义,P＞0.05.结论超声微泡造影剂在超声作用下可明显增强小鼠骨骼肌的基因转染效率;未加超声波作用时,直接肌注携基因的超声微泡造影剂亦可增加小鼠骨骼肌的基因转染效率.     

碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景:以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。目的:构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。方法:实验组:设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组:设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。结果与结论:转染48h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。     

Tiam1基因慢病毒表达载体构建及其在HT29细胞中的表达

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达.方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1 cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定.慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带Tiam1和GFP融合基因的重组慢病毒.取病毒上清感染人结直肠HT29细胞株,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白及免疫细胞化学检测Tiam1在靶细胞中的表达.结果:重组慢病毒质粒pCDF1-Tiam1-copGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的Tiam1基因序列(NM_003253)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293FT细胞,病毒包装效率为88.34%.收获慢病毒上清可高效感染HT29细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,感染效率为55.89%,感染后靶细胞中Tiam1稳定高表达.结论:成功构建了携带Tiam1与GFP融合基因的慢病毒表达栽体pCDF1-Tiam1-copGFP,并使目的基因在靶细胞中得到稳定表达,为进一步研究Tiam1基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体.     

三元复合因子Net基因的克隆及其真核表达

目的克隆人Net基因,构建Net基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中抽提总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出人全长Net cDNA,构建pEGFP-N1/Net重组体质粒,并将其转染入高表达原癌基因c-fos的人胰腺癌细胞PANC-1中,分析转染细胞的Net表达水平和对细胞增殖力的影响。结果从人胰腺癌细胞PANC-1中克隆出长约1 224 bp的Net基因目的片段,成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Net,诱导表达目的蛋白后,Net抑制原癌基因c-fos的表达,进而抑制人胰腺癌细胞的增殖。结论构建重组质粒pEGFP-N1/Net并表达Net融合蛋白,其抑制了细胞的增殖,为进一步研究Net的各种生物学活性及作用机制奠定了基础。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移和存活

目的观察神经干细胞在体内的迁移和存活。方法体外培养胎鼠脊髓神经干细胞,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体进行转染,以乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)为支架移植入大鼠T9半横断脊髓损伤处。移植后1个月在荧光显微镜下观察神经干细胞在脊髓内的迁移,并计算其存活率。结果神经干细胞表达强烈的绿色荧光。细胞移植后1个月,在损伤脊髓的头端和尾端都可见GFP阳性细胞,计算出的存活率为(1.4911±0.0313)%。结论GFP标记的神经干细胞移植入大鼠损伤脊髓后向脊髓组织内迁移并有少数存活。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

基因工程化分泌神经营养因子-3的鼠胚神经干细胞实验研究

目的：探索以Lentivirus为载体,构建同时表达绿色荧光蛋白（GFP）和神经营养因子-3（NT-3）的基因工程化鼠胚神经干细胞（NSC）的可行性.方法：体外分离培养鼠胚NSC,用同时携带NT-3和GFP的lentivirus转染构建工程化NSC：用荧光显微镜、鼠胚背根神经结培养（Dorsal Root Ganglion,DRG）、Western blot等方法检测基因工程NSC的转基因表达.结果：荧光显微镜观察到几乎100%的工程化NSC表达GFP;DRG培养和Western blot检测到基因工程化NSC能高效分泌NT-3蛋白.结论：以Lentivirus为载体,构建同时携带并稳定表达GFP和NT-3的基因工程化鼠胚NSC是可行的,可为脊髓损伤基础研究提供有价值的细胞资源.     

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。     

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.