酵母双杂交系统的发展与细胞信号转导研究

酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法,主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中,通过酵母双杂交系统能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。     

ATRA诱导SP100蛋白表达及其对白血病NB4细胞增殖的影响

目的探讨SP100蛋白在全反式维甲酸(ATRA)作用NB4细胞过程中的表达及其对NB4细胞增殖和周期的影响。方法实时定量PCR检测SP100 mRNA的表达;Western blot检测SP100蛋白的表达;免疫荧光检测SP100的定位;CCK-8检测NB4细胞的增殖;流式细胞术检测NB4细胞的周期。结果 ATRA能明显促进NB4细胞中SP100mRNA水平和蛋白水平,并将SP100由弥散的小点状转变为较大的斑块状;感染SP100-shRNA的NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和病毒空载组(P0.05),并使G2/M期的细胞增多。结论 ATRA促进NB4细胞中SP100蛋白的表达,SP100蛋白可能参与NB4细胞增殖活力的调节。     

中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡

目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。     

酵母双杂交系统在细胞信号转导中的应用

酵母双杂交技术是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与巳知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交技术能较全面地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。     

BPHL与PML-C间相互作用的胞内、外验证

目的 通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证人联苯样水解酶(BPHL)与缺失核定位信号的人急性早幼粒细胞白血病(PML)基因的coiled-coil的结构域(PML-C)蛋白之间的相互作用。 方法 将表达PML-C诱饵蛋白及BPHL靶蛋白的重组质粒pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交实验验证两者在活细胞内的相互作用。构建能在人胚肾293细胞中表达带HA标签的PML-C融合蛋白的重组载体pCMV-HA-PML-C,经酶切鉴定正确后,和表达带myc标签的BPHL融合蛋白的重组真核表达载体pCMV-myc-BPHL,共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C间的相互作用。 结果 pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆。构建的重组表达载体pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL经双酶切鉴定正确后共转染HEK293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-PML-C相互作用蛋白复合物后,用抗c-myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到myc-BPHL的表达蛋白。 结论 成功构建了pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL融合蛋白真核表达重组载体,利用酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术证实BPHL与PML-C之间存在着相互作用。     

订单定向医学生开设《临床基本技能》课程的思考

根据全球医学教育最基本要求,借鉴国内外医学生临床技能培养经验,结合订单定向医学生的未来岗位特点需求,具体分析重庆市订单定向医学生开设《临床基本技能》课程的背景、必要性、可行性。同时,提出保证课程教学质量的对策和建议,以促进课程的顺利开展。     

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。     

苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达的影响

目的观察苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响。方法以终质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的苦参碱作用肺腺癌A549细胞48 h后,通过台盼蓝拒染法计数细胞的生长抑制率;以终质量浓度为0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48、72、96 h后,经透射电镜和DNA Ladder实验了解到细胞凋亡的发生,PCR-TRAP法检测端粒酶活性,实时RT-PCR检测hTERT的mRNA表达水平。结果各种质量浓度的苦参碱作用A549细胞48 h后,均显著抑制细胞的增殖且呈浓度依赖性;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞不同时间后,经透射电镜形态学检测和DNA Ladder实验,均显示A549细胞发生了凋亡改变;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48 h后,端粒酶活性明显受抑,hTERT mRNA表达显著降低。结论苦参碱能抑制肺腺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡,其机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。     

人K562细胞cDNA文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化

目的:对预转化到大肠杆菌DH5 α中的人K562细胞cDNA文库进行扩增、纯化和鉴定并将文库质粒转化酵母细胞,为下一步的靶蛋白筛选做准备.方法:对K562细胞cDNA文库进行扩增,提取文库质粒,将文库质粒转化酵母Y187细胞,并用PCR和酶切鉴定转化结果.结果:成功的扩增人K562细胞cDNA文库、并验证了文库的多样性、将文库质粒成功转化酵母Y187细胞.结论:K562细胞cDNA文库的成功扩增、纯化、鉴定,为进一步的文库筛选奠定了基础.     

测定K562细胞培养液中苦参碱浓度变化的反相离子对HPLC研究

本文建立了一种用于测定苦参碱含量的反相离子对高效液相色谱法（ｉｏｎ－ｐａｉｒＨＰＬＣ）。该法比较准确、可靠，分离效果好，灵敏度高。可用于细胞培养液中苦参碱的分离测定及鉴定。结合样品前处理，作者运用此法对苦参碱在Ｋ５６２细胞培养液中的浓度变化情况进行了初步分析。发现在我们研究的实验条件下，Ｋ５６２细胞培养液中苦参碱的浓度先呈线性下降趋势，以后１－３天则浓度维持不变。