含miR-193b前体基因的重组腺病毒感染K562细胞可抑制其增殖

目的构建小RNA193前体(pre-miR-193b)重组腺病毒,观察miR-193b对慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。方法化学合成miR-193b cDNA序列,克隆进入pAdTrack-CMV穿梭质粒;重组穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得pAd-miR-193b重组腺病毒质粒,经PacI线性化后转入HEK293细胞包装、扩增。倍比稀释法测定病毒滴度。实时荧光定量PCR检测K562细胞中miR-193b表达水平,MTT法检测K562细胞增殖能力。结果pAd-miR-193b重组腺病毒质粒,经限制性内切酶鉴定和测序分析显示构建成功,并能够高效转染K562细胞;与对照组相比,荧光定量PCR检测显示重组腺病毒载体感染K562细胞后,miR-193b基因表达明显增加;同时高表达miR-193b基因的K562细胞增殖水平低于对照组。结论K562细胞高效表达的miR-193b可抑制K562细胞的增殖。     

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。     

人重组腺病毒rAd-IL-23R的构建与功能鉴定

目的构建表达白介素23受体的人重组腺病毒(rAd-IL-23R),并探究该病毒对人子宫颈癌(HeLa)细胞系增殖的影响。方法采用AdEasyTM系统,将带有IL-23R的穿梭载体与腺病毒骨架载体进行同源重组,构建pAd-IL-23R,酶切消化鉴定,线性化的病毒质粒在HEK-293A细胞中进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。CCK-8法检测rAd-IL-23R对HeLa细胞增殖的影响,流式细胞计量术分析和Western blot检测rAd-IL-23R对HeLa细胞凋亡的影响。结果pAd-IL-23R经PacⅠ酶切消化为约30 kb和3 kb的核酸片段,可诱导HEK-293A细胞产生细胞病变,并成功表达IL-23R蛋白;用不同滴度的rAd-IL-23R(0、1和2 MOI)感染HeLa细胞后,rAd-IL-23R对细胞增殖的抑制具有明显的剂量效应(P<0.05),随着MOI增加,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),同时cleaved-caspase 3的蛋白表达水平增高。结论成功构建rAd-IL-23R,该重组腺病毒可抑制HeLa细胞增殖并促进凋亡发生。     

腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响

目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p Ad-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒。Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P0.05)。结论成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础。     

Pre-miR-10a重组腺病毒载体对K562细胞增殖的抑制作用

目的:观察在K562细胞高表达miR-10a对细胞增殖及凋亡的影响。方法:用pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体感染K562细胞,采用RT-PCR检测感染后K562细胞中miR-10a和bcr/abl融合基因的表达水平,Western blot法检测BCR/ABL融合蛋白表达水平,MTT、流式细胞术(FCM)分别检测感染后K562细胞的增殖及凋亡。结果:与对照组相比,K562细胞在转染pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体后,其miR-10a表达水平明显升高、bcr/abl融合基因水平显著降低;BCR/ABL融合蛋白表达明显下调、K562细胞增殖活力被抑制、细胞凋亡增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体能明显抑制K562细胞的增殖、促进细胞凋亡。     

过表达白细胞介素8促进乳腺癌BT549细胞迁移

目的构建含有白细胞介素8(IL-8)基因的重组腺病毒,并观察其对BT549乳腺癌细胞增殖、细胞周期以及迁移能力的影响。方法以143B细胞c DNA为模版,PCR扩增IL-8基因,与穿梭质粒p Ad Track-TO4连接,构建重组穿梭质粒p Ad Track-TO4-IL-8,由PmeⅠ线性化并电转入Ad Easier细菌中,获得重组腺病毒质粒p Ad IL-8,PacⅠ酶切经LipofectamineTM2000介导转入HEK293细胞进行包装扩增,检测滴度;反转录PCR检测BT549细胞中IL-8 mRNA的水平,ELISA检测BT549细胞培养上清液中IL-8的水平;流式细胞术检测细胞周期情况;MTT法检测细胞增殖能力;划痕愈合实验检测细胞迁移能力。结果PCR以及测序证实p Ad Track-TO4-IL-8构建成功;p Ad IL-8经酶切证实重组正确;重组腺病毒Ad IL-8感染BT549细胞,可高表达IL-8。过表达IL-8的BT549细胞迁移能力增强,但其增殖活性无明显变化、将细胞周期阻滞于S期。结论过表达IL-8可促进BT549细胞的迁移。     

携带miR29c重组腺病毒的制备及其促骨髓瘤细胞凋亡作用

目的制备携带miR29c的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,评价miR29c对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法巢式PCR扩增得到hsa-miR29c,将hsa-miR29c基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,得到pShuttle-CMV-miR29c。鉴定正确后,PmeI线性化并转化含Ad5F11p骨架质粒的BJ5183感受态细胞,重组获得腺病毒载体。PacI线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞,制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。以对照病毒Ad5F11p-EGFP感染人骨髓瘤细胞系SKO-007、U266和XG7,通过流式细胞术确定最佳感染复数。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染骨髓瘤细胞,流式细胞术检测miR29c对细胞凋亡的影响。结果 PCR扩增获得miR29c基因,成功将其连接到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,经测序鉴定正确。采用Ad-easy系统,成功构建并制备了CMV启动的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。流式细胞术结果显示,Ad5F11p-EGFP对SKO-007和U266细胞的最佳感染复数为150MOI;而XG7为100MOI。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染细胞48h后,细胞凋亡率升高。SKO-007细胞的凋亡率达到26.5%,XG7细胞的凋亡率达到46.9%。结论成功制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,并证实miR29c能够诱导骨髓瘤细胞凋亡。     

腺病毒介导c-FLIPs基因诱导淋巴细胞抗凋亡作用

目的　探讨表达c FLIPs重组腺病毒诱导淋巴细胞抗凋亡作用。方法　采用RT PCR方法,从人T淋巴细胞株的总RNA中克隆c FLIPs基因;通过pAdeasy系统,构建表达c FLIPs的重组腺病毒Ad c FLIPs;Hochest染色法及PI染色流式细胞仪检测anti Apo 1诱导感染Ad c FLIPs后的H9细胞凋亡。结果　采用RT PCR方法从人T淋巴细胞株中扩增出c FLIPs基因;构建重组腺病毒Ad c FLIPs ;经Hoechst染色,荧光显微镜下观察细胞核的形态,结果发现,经anti Apo 1诱导凋亡处理2 4h后,未经Ad c FLIPs感染的H9细胞有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞;Ad c FLIPs感染的H9细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀低强度荧光;流式细胞仪分析经PI染色后的H9细胞,未经Ad c FLIPs预处理的H9细胞在anti Apo 1作用2 4h后,细胞的凋亡率分别为4 8 33%±7 4 1% ;经Ad c FLIPs预处理1d的H9细胞,其细胞凋亡率分别下降到3 6 0 %±0 2 1%。结论　重组腺病毒Ad c FLIPs可有效地诱导淋巴细胞的抗凋亡作用。     

慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性

目的： 探讨慢病毒载体介导RNA干扰（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。 方法： 构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。 结果： 构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con（转导空载体）组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562 -con组细胞明显增高(P<0.05)。结论： 慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。     

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响.方法 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡.结果 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1 ×1010pfu/mL;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75％,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P＜0.05),S期细胞比例明显增高(P＜0.05),G2期细胞比例明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P＜0.05).结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡.     

SU11248诱导K562白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的:研究SU11248(舒尼替尼)诱导慢性骨髓性白血病K562细胞凋亡的分子机制。方法:采用CCK-8比色检测SU11248对K562细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测K562细胞周期变化;间接免疫荧光检测凋亡相关蛋白的表达及定位;免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果:CCK-8比色显示SU11248可明显抑制K562细胞增殖(P<0.05),呈现剂量和时间依赖性。FCM显示该药可阻滞K562细胞于G0/G1期。间接免疫荧光染色可见SU11248组细胞色素C(Cyto C)在胞质中呈弥散或粗块状分布,而p53、p73及NF-κB p65均主要定位于胞质,较对照组表达差异不明显。免疫印迹显示,随时间延长,SU11248组较对照组Bcl-2表达呈下降趋势,Bax和Cyto C表达呈增加趋势,同时有Caspase-9和Caspase-3的激活,而p53、p73及NF-κB p65表达变化不明显。结论:SU11248可通过阻滞细胞周期进程及激活内源性线粒体凋亡通路诱导K562细胞调亡。     

腺病毒细菌重组系统表达Crg-2蛋白的实验研究

目的利用腺病毒的细菌重组系统表达同时具有免疫趋化及血管抑制活性的趋化性细胞因子Crg-2重组蛋白。方法首先在大肠杆菌BJ5183中将穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与AdE1区基因缺失的骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,筛选后脂质体法转染入具有AdE1区组成性表达的293包装细胞中进行病毒包装、扩增;Westernblot检测病毒感染293细胞的蛋白表达;趋化实验检测感染细胞上清对激活T淋巴细胞的趋化活性。结果穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与骨架质粒pAdEasy-1重组后,经酶切及PCR鉴定获得重组腺病毒基因组质粒pAd/crg-2;病毒Ad/crg-2经包装并扩增后,用组织培养感染半数剂量法(TCID50)法测定病毒滴度达4×109TCID50/L,感染细胞经Westernblot检测有一接近Mr10000蛋白条带,分泌上清对激活的脾淋巴细胞有明显的趋化作用。结论采用细菌重组法成功获得重组腺病毒Ad/crg-2,可高效表达趋化性细胞因子Crg-2。     

靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(r-caspase-3)重组腺病毒体外诱导肝癌细胞凋亡的效果和特异性.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(ALB)启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),亚克隆r-caspase-3至载体pAdTrack-EAFP-PALP,Pme Ⅰ线性化pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3,电转化至BJ/AdEasy菌,获得重组腺病毒骨架pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3.Pac Ⅰ酶切后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增、获得病毒.绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;RT-PCR和Western印迹法检测r-caspase-3在HepG2细胞中的表达;流式细胞术检测其特异性诱导肝癌细胞凋亡的作用.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdeasy-1载体同源重组后PCR及Pac Ⅰ酶切鉴定结果表明pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3重组成功.转染AD293细胞后可观察到GFP的表达.病毒感染HepG2细胞总DNA经RT-PCR和Western印迹均可检测到目的 基因的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3病毒颗粒包装成功;靶向性r-caspase-3重组腺病毒感染各组细胞24 h后,各组凋亡指数分别为:HepG细胞48.2%、7721细胞17.7%、L-02细胞7.3%、MDA-MB-231细胞0%.结论 成功构建了靶向性Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3重组腺病毒,体外实验表明其具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能提供了依据.     

cFLIPL和cFLIPS腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建并鉴定cFLIP_L和cFLIP_S重组质粒,并观察其在乳鼠心肌细胞中表达并检测转染效率。方法 :利用基因合成技术获取cFLIP_L和cFLIP_S基因,分别连接pAd-CMV-GFPa1-IRES载体质粒,并转移至穿梭质粒pAdcFLIP_L和pAd-cFLIP_S,经挑选、扩培后进行酶切验证及测序鉴定、包装、扩增、纯化获得一定滴度的pAd-cFLIP_L和pAd-cFLIP_S,之后感染原代乳鼠心肌细胞,观察两者在心肌细胞中的荧光表达并用流式细胞仪检测转染效率。结果 :酶切验证与理论值相符,测序鉴定结果与目的基因序列一致;pAd-cFLIP_L和pAd-cFLIP_S感染人胚肾293A细胞后可见大量绿色荧光蛋白表达和聚集,10 d后出现典型的细胞病变,腺病毒包装成功,并测得滴度均为1×10~9pfu/ml;同时,在荧光显微镜下可见重组腺病毒感染可在乳鼠心肌细胞中稳定表达并发出绿色荧光,流式细胞仪检测结果显示其转染效率为90.30%±3.62%。结论 :成功构建cFLIP_L和cFLIP_S重组腺病毒表达载体且证实其能安全、有效地感染乳鼠心肌细胞。     

重组人可溶性TRAIL的制备及其联合硼替佐米诱导肿瘤细胞的凋亡作用

目的:构建重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)原核表达质粒p ET-28a(+)-TRAIL114-281,优化蛋白表达和纯化条件,制备重组人可溶性TRAIL并鉴定其活性。方法:使用CCK-8初步验证TRAIL是否具有抑制肿瘤细胞生长的生物活性;将制备的TRAIL单独或联合50 nmol/L硼替佐米应用于H460细胞(对TRAIL敏感)和K562细胞(对TRAIL抵抗)24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测caspase-8、-9、-3的活化程度,Western blot分析细胞中Bax、Bcl-2和c FLIP蛋白的表达。流式细胞术检测硼替佐米处理H460细胞和K562细胞24 h后DR4和DR5的表达量变化。结果:制备了具有生物学活性且性质稳定的重组人可溶性TRAIL,且成功诱导H460和K562细胞凋亡。不同浓度TRAIL处理H460细胞后其凋亡率随着TRAIL浓度升高而显著升高(P0.05),但K562细胞凋亡率并未随着TRAIL浓度明显升高。联合用药组的H460和K562细胞凋亡率均显著高于单独用药组(P0.05),凋亡过程中caspase-8、-9、-3均被活化,药物处理组的Bcl-2和c FLIP表达量均比对照组下降,尤其联合用药组表达量下降最为显著(P0.05),而Bax表达量无明显变化。硼替佐米处理H460和K562细胞后DR4和DR5表达量均上调(P0.05)。结论:硼替佐米能协同TRAIL启动内源性凋亡途径诱导H460和K562细胞凋亡,其可能机制是通过上调死亡受体DR4和DR5的表达量、下调抗凋亡蛋白Bcl-2和c FLIP的表达量来实现的。     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子(TFPI)与绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

siRNA沉默RALA基因影响人白血病K562细胞增殖和凋亡

目的: 研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral 猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表达对人慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法: 利用Lipofectamine^TM 2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RALA siRNA对K562细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对K562细胞存活率的影响;real-time PCR检测RALA mRNA表达水平;Western blotting检测RALA蛋白表达水平;annexin V/PI双染流式 细胞仪检测RALA siRNA对K562细胞凋亡的影响;Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态学变化。结果: RALA siRNA可明显抑制K562细胞内RALA mRNA和蛋白的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,转染RALA siRNA的K562细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);流式细胞术结果显示转染RALA siRNA的K562细胞凋亡较阴性对照组显著增加(P<0.05);Hoechst 33258染色见转染RALA siRNA的K562细胞出现典型的凋亡形态学变化。结论: 癌基因RALA在白血病发生发展过程中发挥重要作用。siRNA下调RALA mRNA和蛋白的表达,可抑制人白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示RALA可能是白血病治疗的新靶点。     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）与绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞（EPCs）中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

鲨鱼软骨制剂通过下调Bcl-2诱导K562细胞凋亡

目的探讨鲨鱼软骨制剂(SCP)诱导人红白血病细胞系(K562)凋亡的作用机制。方法以不同浓度SCP加入体外培养的K562细胞中,用MTT比色法检测细胞存活率;Hoechst33342/PI荧光染色,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率;流式细胞术进行细胞凋亡定量;免疫细胞化学染色法检测Bcl-2蛋白的表达。结果SCP明显抑制K562细胞生长,IC50值为1mg/ml以下;荧光显微镜下可见50%以上细胞为凋亡细胞的形态学改变;免疫细胞化学检测显示SCP诱导细胞凋亡过程中Bcl-2表达明显降低。结论SCP诱导K562细胞凋亡,可能与下调Bcl-2表达有关。     

PDZ1-腺病毒重组体的构建及其对KA诱导的海马神经元凋亡的拮抗作用

目的构建PSD-95结构域PDZ1与腺病毒重组体并观察其对海人藻酸(KA)诱导的海马神经元凋亡的作用。方法采用RT-PCR法获得PDZ1的cDNA;与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用T4 DNA连接酶连接;连接产物与骨架载体pAdEasy-1共转染至原核包装细胞BJ5183;将原核重组体用脂质体转入真核包装细胞293H;纯化包装后的病毒颗粒并测定其滴度;腺病毒感染培养的海马神经元,加入KA,用DAPI染色后荧光显微镜观察细胞凋亡;用流式细胞仪定量分析细胞凋亡率。结果①经RT-PCR得到了PDZ1的cDNA;②电泳鉴定得到原核重组体;③得到包装完整的具感染能力的病毒颗粒;④纯化的病毒颗粒滴度为1.08×109ifu/mL⑤病毒表达的PDZ1使KA诱导的海马神经元凋亡数量减少(P<0.05)。结论获得了能表达PDZ1-GFP的病毒颗粒,并且PDZ1过表达能拮抗KA诱导的海马神经元凋亡。