小鼠卵巢玻璃化冻存中FSH干预对移植卵巢VEGF和VEGFR-2表达的影响

目的 通过在玻璃化冻存液中给予重组人促卵泡刺激素（rhFSH）,观察冻存卵巢异体异位移植后VEGF和VEGFR-2表达的变化,探索卵巢玻璃化冻存中的FSH干预对移植卵巢血流重建相关因子的影响.方法 对4周龄C57BL/6J小鼠卵巢进行异体肾被膜下移植,实验分为新鲜移植组（FCG）、单纯玻璃化冻存移植组（VCG）和0.3IU·mL^-1 FSH干预玻璃化冻存移植组（VG-FSH）.通过监测受体小鼠动情周期的变化、卵巢组织切片中正常卵泡百分比、移植后2、7、14、28d卵巢VEGF及其受体VEGFR-2的表达,判断FSH干预效果.结果 FSH干预冻存组的正常卵泡数、VEGF及VEGFR-2的表达均高于单纯玻璃化冻存组（P＜0.05）,且均低于新鲜移植组;FSH干预冻存组动情周期恢复所需时间明显低于冻存组（P＜0.05）,而明显长于新鲜移植组（P＜0.05）.结论 玻璃化冻存全程添加FSH干预,有利于冻存卵巢移植后的卵泡存活及功能恢复,可能与上调促血管生成的VEGF、VEGFR-2蛋白的表达有关.     

RHO/ROCK信号通路在精子抗冷冻损伤中的作用

目的:探讨RHO/ROCK信号通路在人精子抗冷冻损伤中的作用,为高效精液冷冻保护剂的研制提供理论依据。方法:选取健康精液25份,每份精液分为新鲜组、对照组与RHO通路抑制剂组(抑制剂组)。检测冷冻前后各组精液精子活力、精子存活率、精子膜完整率、正常形态精子百分率、精子DNA碎片指数(DFI)、精子顶体酶活性及精子线粒体膜电位变化;免疫荧光染色检测RHOa/ROCK蛋白在精子中的表达。结果:抑制剂组精液冷冻复苏后精子活力[(57.50±6.83)%vs(51.20±7.70)%,P=0.002]、精子存活率[(60.24±5.53)%vs(52.87±5.07)%,P=0.001]、精子膜完整率[(67.10±4.43)%vs(59.78±5.56)%,P=0.001]、正常形态精子百分率[(7.46±1.28)%vs(4.83±1.11)%,P=0.001]、精子DFI[(18.87±4.07)%vs(27.64±6.64)%,P=0.001]、精子线粒体膜电位(63.11±2.97 vs 56.30±4.28,P=0.001)指标均明显优于对照组;抑制剂组冷冻后精子顶体酶活性与对照组差异无统计学意义(98.30±11.33 vs 97.65±9.31,P0.05)。免疫荧光染色显示RHOa/ROCK蛋白在精子头、颈部广泛表达。结论:RHO/ROCK信号通路在精子冷冻损伤中具有一定作用,抑制其通路活性可明显提高精子抗冷冻损伤的能力。     

玻璃化冷冻对乳鼠卵巢Dnmt1和Grb10的影响研究

目的探索玻璃化冷冻对乳鼠卵巢Dnmt1和Grb10 mRNA和蛋白表达的影响。方法 26只出生10 d的C57BL/6雌性小鼠,每只乳鼠双侧卵巢均分成新鲜组和玻璃化冷冻组。免疫组织化学法检测Dnmt1蛋白在玻璃化冻融前、后卵巢组织卵泡中的表达变化;通过qRT-PCR检测Dnmt1和Grb10 mRNA在玻璃化冻融前、后卵巢组织中的表达变化;通过Western blotting方法检测Dnmt1和Grb10蛋白在玻璃化冻融前后卵巢组织中的表达变化。结果 Dnmt1在玻璃化冻融前、后的乳鼠卵巢组织各级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞胞核表达。与新鲜组相比,玻璃化冷冻组卵巢内Dnmt1蛋白和mRNA表达水平均显著下调(P0.05);Grb10蛋白和mRNA表达水平均显著上调(P0.05)。结论玻璃化冷冻复苏过程导致卵巢内Dnmt1表达降低,使印记基因Grb10过表达,可能使配子糖代谢性表观遗传信息紊乱的的风险增加。     

硒蛋白H减缓谷氨酸对神经细胞损伤的作用

目的探讨硒蛋白是否可以缓解谷氨酸(glutamate,Glu)对神经细胞的损伤。方法利用转入硒蛋白基因的HT-22细胞株(Sel H)和HT-22加空病毒载体细胞株(HT+V)两种细胞株作为研究对象。分别分为:HT+V对照组、HT+V Glu组、Sel H对照组和Sel H Glu组,MTT法处理Glu(4×10~(-3)mol/L)6、10、24 h后检测各组细胞的抑制率,用倒置显微镜、透射电镜观察各组细胞形态及超微结构的变化,采用氧自由基(ROS)特异性标记探针DHE对各组细胞进行标记,用荧光电子显微镜观察ROS标志物的产生。结果 Sel H转染细胞在Glu损伤6、10、24 h后生长抑制率分别为(2.9±0.023)%、(17.3±0.018)%、(20.4±0.029)%,明显低于空载体对照组(P0.05)。倒置显微镜观察显示:HT+V Glu组细胞明显较HT+V对照组减少,细胞体积缩小,皱缩。Sel H Glu组处理后细胞数量虽比Sel H对照组数量减少,但较空载体处理组数量明显增多。透射电镜观察结果显示:与HT+V Glu组相比Sel H Glu组凋亡细胞数目减少,线粒体、内质网的损伤减轻。荧光电子显微镜观察结果显示:Sel H Glu组DHE(特异性标记ROS)染色的平均光密度值(0.024 3±0.001 6)明显低于HT+V Glu组(0.048 0±0.001 6)(P0.05)。结论硒蛋白H可以减缓Glu导致的神经细胞损伤,硒蛋白H可能通过减少受损神经细胞ROS产生实现减缓Glu对神经细胞损伤的作用。     

司法鉴定融入法医学课程助力高素质医学留学生培养

在留学生法医学课程中增设司法鉴定相关内容,将真实典型的法医病理、法医临床案例融入留学生法医学教学,助力高素质创新型医学人才培养。     

小鼠卵巢内质网应激模型的建立及诱导凋亡的研究

目的通过观察内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)及ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)对ERS相关标识性蛋白表达水平的影响,建立小鼠卵巢ERS模型。方法取4周龄昆明白小鼠卵巢,进行半卵巢培养。实验分组:新鲜对照组,不同浓度TM诱导组(1、5、10、20、30μg·mL-1),TUDCA+TM组、不同浓度TUDCA(1、2、5、10mM)+TM组。通过免疫组织化学技术观测培养1h卵巢内内质网应激伴侣蛋白GRP78、培养3h后ERS凋亡相关蛋白CHOP的表达水平;TUNEL法检测培养3、6、12、24、36、48h后卵巢细胞凋亡情况。结果与新鲜组相比,TM诱导1h后卵巢发生内质网应激反应,TM浓度为5-10μg·mL-1时GRP78表达水平达到最高(P<0.05),之后随TM浓度增加缓慢递减;TM诱导3h后卵巢内ERS凋亡相关蛋白CHOP表达水平在TM 10μg·mL-1处达到最高(P<0.05),凋亡细胞数随着培养时间的延长增加。TUDCA抑制ERS实验显示,随着TUDCA浓度的增大,10μg·mL-1TM诱导的GRP78蛋白表达呈递减趋势,其中TUDCA 10mM组GRP78表达水平基本恢复到新鲜组水平。结论 TM可诱导小鼠卵巢ERS,5μg·mL-1为诱导ERS保护作用浓度,而10μg·mL-1以上则产生ERS途径介导的凋亡。TUDCA可抑制TM诱导的卵巢ERS。     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞体外培养模型的建立

目的探讨人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)体外原代培养及功能检测的可靠方法。方法采用改良的胶原酶灌注消化法分离HUVEC,用免疫荧光法鉴定细胞纯度;用血清+DMSO冻存HUVEC,用Edu法检测细胞增殖能力,Matrigel体外成管实验检测血管内皮细胞功能。结果培养得到高纯度(99%)、高数量(1×106~3×106)、高质量(增殖与成管能力均良好)的原代细胞。结论建立了分离、培养、保存HUVEC及对其功能检测的可靠方法,为血管新生研究提供了理想的细胞模型和实验思路。