rhBMP-2m在高浓度条件下的复性

目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法: 将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22 μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果: 经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论: 高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.     

不同复性方法制备的rhBMP-2m诱导异位成骨活性比较

目的:用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP-2m),比较其异位诱骨活性.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的rhBMP-2m用三种不同方法复性:①对pH 4.8复性液透析复性;②对pH 9.0复性液稀释复性;③对pH 6.5复性液透析复性.不加任何载体,1 mg复性后rhBMP-2m直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成.结果:得到纯度为98%的rhBMP-2m.①pH 4.8透析复性后蛋白可溶.经过滤除菌,可溶性rhBMP-2m没有损失.冻干后植入肌袋,2 wk后诱导生成软骨,4 wk诱导生成骨小梁.②pH 9.0稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶,但经除菌膜过滤rhBMP-2m损失90%以上.冻干后植入肌袋,1 wk诱导生成软骨,2 wk诱导软骨内成骨,3 wk出现骨小梁.③pH 6.5透析复性后蛋白不可溶,植入肌袋,2 wk诱导生成骨小梁,4 wk后出现骨髓样细胞.结论:相比酸性和碱性条件,中性条件下复性的rhBMP-2m的诱骨活性最好,但酸性条件下复性的rhBMP-2m溶解度好.     

hErmin160蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的:对hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)蛋白进行表达、鉴定和纯化并制备其多克隆抗体,为研究hEr-min功能奠定基础.方法:PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其多克隆抗体,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-Blot检测抗体纯化的效果.结果:测序证实获得hEr-min氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51 ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%;Western Blot确认所表达的蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体Westerm Blot反应均为阳性.结论:利用大肠杆菌融合表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hEr-min160多克隆抗体.     

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的 探讨影响大肠杆菌DH5 a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素.方法 于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5 a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞.在电压2.5kv、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率.结果 于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高速1.01×1010CFU/μg DNA.结论 该法适合于大肠杆菌DH5 a,可获得较高的转化效率.     

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用

目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.