铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究

目的测定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的最佳感染复数、一步生长曲线和吸附K值及交叉吸附K值等基本生物学特性。方法按照感染复数（MOI）分别为0．0001、0．001、0．01、0．1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌，充分裂解细菌后，测定噬菌体滴度；以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌，进行一步生长实验；纯化PaP3颗粒，免疫家兔，获得抗血清，通过中和反应实验测定PaP3和其抗血清之间的吸附反应常数K值。同时，利用抗血清交叉中和试验确定本室分离的三株噬菌体之间的血清学关系。结果当MOI=0．001时PaP3感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高；根据一步生长实验结果绘制一步生长曲线；通过血清交叉中和反应得出不同的吸附常数。结论PaP3最佳感染复数为0．001，感染宿主菌的潜伏期是20min，爆发期是60min，平均爆发量约为31，其抗血清反应的吸附常数K值为262。     

医学微生物课堂教学中建构主义理论的应用

为改变医学微生物学课堂教学中沉闷乏味以及学生积极性差的现象,以建构主义学习理论为指导,采用"情景创设-多模式结合-强调协作-总结归纳-促进迁移"的课堂教学模式,从根本上改变单向灌输式的课堂教学模式,充分调动学生的积极性和创造性,增强学生的综合素质,并切实提高医学微生物学的教学质量.     

行为主义与建构主义相结合的医学生物化学教学探索

为解决医学生物化学教师难教学生难学的现状,依托认知心理学理论,结合建构主义和行为主义各自的优势,对传统的医学生物化学的教学模式进行改革和探索。教学中依据课程内容特点,学生专业特点以及学习阶段特点三方面因素,合理应用认知心理学设计教学模式,教师引导学生进入课程主体,培养学生的主动参与自我构建,激发学生的学习兴趣,增强了学生的综合素质,切实提高了医学生物化学的教学质量,值得应用和推广。     

医学院校生物化学课程中糖脂代谢章节的教学探讨

糖脂代谢是生物化学课程中的重点、难点内容之一。从概括代谢的学习规律和特点，提出学习方法；针对每章或节设计问题，引起学生注意，激发学习兴趣；指出每一节的目的和意义，使学生从整体上把握学习内容等方面进行了教学探讨，期望能使学生在有限的时间内较好地、全面地、系统地掌握糖脂章节的相关知识。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探

目的:研究将铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组DNA电转入其宿主菌并获得噬斑的基本条件。方法:以铜绿假单胞菌PA3作受体菌,将噬菌体PaP3基因组DNA通过电转化导入受体菌中,研究细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度和细胞密度等条件对转化效率的影响。结果:在含50μg/ml红霉素的LB培养液中培养宿主菌14~16 h,以100 mmol/L蔗糖溶液为介质,在25℃条件下制备感受态并使其浓度达到1011/ml,电转参数为12 kV/cm,300Ω,25μF,在此组条件下能获得较高的转化效率,最高可达2.1×103pfu/μg的DNA。结论:确定了一组电转条件,成功地将铜绿假单胞菌噬菌体完整基因组导入PA3中,并形成噬斑,为铜绿假单胞菌噬菌体的深入研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的　确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法　电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果　噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论　PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3 4     

人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的：对已构建的人肽抗生素hPAB-β 1～8拷贝串联基因工程菌进行筛选，并对其优势菌株进行发酵研究，为hPAB-β的规模生产奠定基础。方法：对1～8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后，选择2～5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较，确定最佳多拷贝菌；对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。结果：在相同条件下，3拷贝菌产量(3．153g／L)最高，目标蛋白表达率(27．8％)接近最高水平，包涵体能溶解完全；利用亲和层析能成功捕获融合蛋白，后者经羟胺裂解，可获得相对分子质量与合成hPAB-β成熟肽大小相符的小肽，筛选出的优势菌传代稳定，其最佳摇瓶发酵条件为37℃，160r／min条件下，在改良M9-cAA培养液中培养至吸光值(A600)≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的IPTG诱导表达5h。结论：确定了3拷贝菌为最佳多拷贝菌，并确定了其最佳摇瓶发酵参数。     

推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

目的 检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力.方法 通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JMl109后,IPTG诱导表达目的 蛋白,超声裂菌后发现目的 蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白.利用PCR与酶切方法 获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3'端进行生物素标记.最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力.结果 成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中.经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合.结论 成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础.     

医学生物技术专业基因工程教学的体会

为了讲好医学生物技术专业学生的基因工程课程,依据教学经验,从教学内容、教学方法以及课外教学等方面提出了一些教学体会和思考,通过改革教学内容,加强绪论的讲解,采用案例教学和读书报告等方法,并增加课外实践和见习等方式,可激发学生学习兴趣,提高教学效果.