应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

Survivin、Bcl-2的表达与鼻咽癌相关

背景与目的研究凋亡抑制基因Survivin、Bcl-2在鼻咽癌中的表达及其与鼻咽癌的相关性。材料与方法应用免疫组化分析68例鼻咽癌组织、45例鼻咽慢性炎症组织中Survivin和Bcl-2的表达;RT-PCR分析24例鼻咽癌组织、18例鼻咽慢性炎症组织中Survivin和Bcl-2的表达。结果免疫组化分析表明,鼻咽癌组织中,Survivin、Bcl-2的表达阳性率分别为69.1%(47/68)和79.4%(54/68),鼻咽慢性炎症组织中Survivin、Bcl-2的表达阳性率分别15.6%(7/45)和13.3%(6/45),对两组标本中的Survivin、Bcl-2分别进行比较,差别均有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR分析表明,鼻咽癌组织中,Survivin、Bcl-2的表达阳性率分别为79.2%(19/24)和87.5%(21/24),鼻咽慢性炎症组织中Survivin、Bcl-2的表达阳性率分别22.2%(4/18)和27.8%(5/18),对两组标本中Survivin、Bcl-2分别进行比较,差别均有统计学意义(P<0.01)。结论Survivin、Bcl-2的表达与鼻咽癌相关,两者的表达可能在鼻咽组织癌变过程中起重要作用。     

短发夹RNA对肝癌细胞细胞间粘附分子-1基因表达的影响

目的利用小片段干扰RNA（siRNA）在肝癌细胞内诱导RNA干扰（RNAi），抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的实验研究。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断，构建pGenesil-1／ICAM-1表达载体，转入E．coli菌，并用Lipofectamine tm2000转染HepG2细胞，通过MTT方法检测细胞活性状态，应用免疫组织化学的方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因蛋白质表达抑制情况。结果本实验已成功构建了针对ICAM-1基因的pGenesil-1／ICAM-1质粒，免疫组织化学结果显示：RNA干扰（RNAi）能特异而有效地抑制HepG2细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pchlesd-1／ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株HepG2中的表达和瘤细胞增殖。     

五倍子提取物抗鼻咽癌5-8F细胞的作用及机制

目的:探讨五倍子提取物鞣花酸抗鼻咽癌细胞的生物学活性及其分子机制。方法:体外培养鼻咽癌5-8F细胞,用2,4,6μg/mL鞣花酸处理48 h后,采用M实验分析细胞的增殖;Hoechst33258染色分析细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞周期;Western印迹检测蛋白表达。结果:鞣花酸对5-8F细胞增殖有抑制作用,2,4,6μg/mL抑制率分别为(29.35±4.95)%,(53.32±4.44)%和(61.75±6.93)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);2,4,6μg/mL鞣花酸处理组S期细胞百分率分别为(25.47±0.74)%,(28.08±1.41)%和(35.49±0.66)%,与对照组(21.26±0.70)%比较,差异有统计学意义(P<0.01);随药物浓度增加,核固缩浓染的凋亡细胞明显增多,COX-2和stathmin蛋白表达下调。结论:五倍子提取物鞣花酸有抗鼻咽癌细胞的作用,其机制可能与COX-2和stathmin下调相关。     

鞣花酸抗肝癌作用的相关分子

目的 探索五倍子提取物鞣花酸抗肝癌生物学活性的相关分子.方法 鞣花酸体外孵育肝癌HepG-2细胞,采用细胞形态学、四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和Hoechst33258染色分析细胞的增殖与凋亡;Westera-blotting分析基因表达.结果 鞣花酸剂量依赖性抑制HepG-2细胞增殖,诱导其凋亡;鞣花酸抑制肿瘤相关基因CtBP、Stathmin和COX-2的表达,随鞣花酸浓度升高,抑制作用增强.结论 鞣花酸通过抑制CtBP、Stathmin和COX-2的表达发挥抗肝癌的生物学作用.     

Stathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系建立

目的 建立stathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系,为stathmin在鼻咽癌中的生物学功能研究提供实验基础.方法 合成stathmin特异性干扰DNA片段,将合成的干扰DNA片段克隆到siRNA质粒表达载体pGenesil-1.1,载体导入JM109菌株进行扩增,酶切和测序对重组表达载体进行鉴定.应用脂质体将质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞,采用G418进行筛选;RT-PCR和Western blot检测stathmin表达.结果 酶切和测序分析证实,插入siRNA质粒表达载体中的stathmin干扰DNA片段的序列和方向正确.表达分析表明,构建的stathmin特异性siRNA质粒表达载体能有效沉默stathmin在鼻咽癌5-8F细胞中的表达.结论 sathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系建立成功.     

d-δ-三烯生育酚对鼻咽癌细胞增殖的影响

目的探讨d-δ-三烯生育酚抗鼻咽癌的生物学活性。方法将低分化5-8F鼻咽癌细胞随机分为观察组和对照组,观察组分别予40、50、60panol／Ld-δ-三烯生育酚干预48h,对照组不予干预。采用MTT实验、流式细胞仪检测细胞增殖抑制率、凋亡率及细胞周期;荧光染色和显微镜观察细胞形态学变化。结果观察组干预48h后,随浓度增加,镜下观察活细胞减少,漂浮的死亡细胞增多,细胞核强荧光染色细胞比例增多,细胞出现明显的抑制和凋亡现象。观察组不同浓度细胞抑制率及凋亡率明显升高,且明显高于对照组（P均〈0．01）;对照组S期的细胞百分率明显低于观察组,P均〈0．01。结论d-δ-三烯生育酚能抑制5--8F细胞增殖,诱导其凋亡,具有潜在的抗鼻咽癌生物学活性。     

SiRNA-Survivin增强鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究

目的 研究Survivin表达抑制对鼻咽癌放射敏感性的影响,探讨Survivin基因为靶的分子干预在鼻咽癌放疗中作用.方法 采用脂质体将Survivin特异性siRNA转染鼻咽癌5-8F细胞系,半定量RT-PCK、流式细胞仪检测Survivin基因表达;Survivin特异性siKNA转染5-8F细胞,培养24 h后,用6 GY的放射线处理细胞,继续培养24h后,收集细胞.流式细胞仪、镜下计数检测细胞增殖、凋亡与细胞周期.结果 Survivin特异性的siRNA能有效地阻断5-8F细胞系中Survivin基因表达.特异性SiRNA加放射组,细胞抑制率 (33.7±1.5%) 显著高于特异性SiRNA组[ (23.8±4.3) %,(P<0.05) ]和随机序列的siRNA加放射组[ (15.5±1.7) %,(P<0.01) ].特异性SiPNA加放射组,细胞凋亡率 (24.67±0.50) 显著高于特异性SiRNA组[ (20.30±0.44) ,(P<0.05) 1和随机序列的siRNA加放射组[ (6.58±0.38) ,(P<0.01) ].特异性siRNA加放射组,S/G_1比率 (2.76±0.186) 显著高于特异性siRNA组[ (1.91±0.067) ,(P<0.01) ]与随机序列的siRNA加放射组[ (0.585±0.066) ,(P<0.01) ].结论 有效干预Survivin基因表达能提高鼻咽癌细胞的放射敏感性,增强鼻咽癌的放疗效果.     

急性缺血性中风病中医证型与同型半胱氨酸水平关系探讨

目的探讨急性缺血性中风病(脑梗死)中医辨证分型与血清同型半胱氨酸(Hcy)水平的关系。方法 168例急性缺血性中风病病人辨证分为7个证型:风痰瘀阻证、气虚血瘀证、风痰火亢证、痰热腑实证、风火上扰证、阴虚风动证、痰湿蒙神证,分别测定其血清Hcy水平,比较各证型Hcy值。结果 168例急性缺血性中风病病人中医证型主要为风痰瘀阻、气虚血瘀、痰热腑实、阴虚风动4型;各证型Hcy均有不同程度升高,差异具有统计学意义(P0.05),而气虚血瘀、痰热腑实证病人Hcy值升高明显,这二型之间Hcy值比较差异无统计学意义(P0.05)。结论急性缺血性中风病因中医辨证不同,其血清Hcy水平也不等,Hcy水平可作为急性缺血性中风病中医辨证分型的参考指标,同时气虚血瘀型、痰热腑实证亦是缺血性中风病的高危证型,临床需要高度重视、早期干预。