gp350及gp350-C3d3融合基因真核载体的构建及其免疫功能研究

目的构建EB病毒包膜糖蛋白gp350全长序列及其与3个补体片段C3d串联基因在人体真核细胞中表达的载体,并进行其免疫功能的初步研究。方法将gp350基因序列分别与经BglⅡ和BamHⅠ双酶切的真核表达载体pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d3.YL连接,转化后挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定并测序;将重组载体利用脂质体法分别转染人类Hela细胞培养16~24 h后,用Western blot及细胞免疫组化染色检测gp350蛋白和gp350-C3d3融合蛋白的表达。结果成功构建含gp350全长基因序列的载体pSG.SS.gp350.YL和pSG.SS.gp350.C3d3.YL,并能够转染人类Hela细胞;经细胞免疫组织化学染色及Westernblot蛋白检测转染组均能常规水平表达,对照组则无该蛋白表达,但两转染组的表达量无明显差异。结论构建成功含有gp350的2个真核表达质粒并能够在人体细胞中表达相应蛋白,为下一步进行检测功能性试验奠定基础。     

TNF-α通过死亡受体途径促进IFN-γ诱导NIT-1细胞凋亡

目的：探讨TNF-α和IFN-γ对小鼠胰岛β细胞株NIT-1细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法：用MTT法检测TNF-α和IFN-γ单独或联合作用对NIT-1细胞活力的影响,倒置显微镜观察NIT-1细胞形态变化,Hoechst 33258荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞核形态的变化,Western blot技术检测凋亡相关蛋白Caspase-8,-3和PARP的活化。结果：TNF-α联合IFN-γ处理明显抑制了NIT-1细胞的活力,诱导了细胞的凋亡,促进了凋亡蛋白Caspase-8,-3和PARP的活性。结论：TNF-α通过细胞凋亡的死亡受体途径信号传递促进了IFN-γ诱导的NIT-1细胞凋亡。     

肺炎链球菌肺炎对肺部树突状细胞及CD4~+T细胞的影响

目的探讨肺炎链球菌肺炎对Balb/c小鼠肺部树突状细胞及CD4~+T细胞的影响。方法 6~8周Balb/c小鼠随机分为对照组及肺炎链球菌感染组,流式细胞术检测肺炎链球菌感染后2 d、5 d肺组织中CD103~+DCs、CD11b~+DCs、p DCs及CD4~+T细胞亚类水平。结果肺炎链球菌肺炎致肺组织CD103~+DCs及p DCs水平显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(P0.01),而肺组织CD11b~+DCs水平显著低于对照组。肺炎链球菌肺炎促进肺组织IL-17A~+CD4~+T细胞和Foxp3~+Tregs表达,与对照组比较,感染后2 d、5 d差异均有统计学意义(P0.05),随着感染控制,Foxp3~+Tregs表达水平回降,感染后5 d Foxp3~+Tregs水平显著低于感染后2 d水平(7.3%±0.41%vs 9.38%±1.34%,P0.01)。肺炎链球菌肺炎对肺部Th2表达水平无显著影响,感染后5 d IFN-γ~+CD4~+T细胞水平显著升高,与对照组、感染后2 d组比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论肺炎链球菌肺炎促进肺组织CD103~+DCs、p DCs表达,诱导CD4~+Th17、Tregs细胞分化发育。     

LIHGT-HVEM/LTbR途径缺陷诱导T细胞的失能

目的探讨LIGHT-HVEM/LTbR信号通路缺陷对T细胞应答的影响。方法以LIGHTKO小鼠为动物模型,制备脾脏单细胞悬液,加入抗CD3mAb和抗CD28mAb刺激。通过3H-TdR掺入法检测了细胞的增殖能力、ELISA和FACS分别检测了细胞培养上清和胞内IFN-gamma和IL-10的水平,并探讨了这些细胞对外源性rIL-2的反应性。结果与野生型的C57BL/6小鼠相比,LIGHTKO小鼠的脾细胞表现为低下的增殖活性(P<0.05);细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-gamma的水平显著下降(P<0.05);与ELISA结果一致,FACS胞内染色结果表明,IFN-gamma阳性T细胞的百分率显著下降,而LIGHTKO小鼠脾细胞IL-10的产生却显著高于野生型的对照小鼠(P<0.01)。进一步的研究表明LIGHTKO小鼠这种缺陷的IFN-gamma产生主要与CD8+T细胞亚群有关,而CD4+T细胞亚群IFN-gamma的产生是正常的。外源性rIL-2的加入可使LIGHTKO小鼠T细胞恢复正常的增殖能力和IFN-gamma的产生。结论 LIGHT-HVEM/LTbR信号通路缺陷导致T细胞的失能。     

C5a/C5aR通路在硕大利什曼原虫易感小鼠免疫病理发生中的作用及其机制

目的研究C5a/C5aR通路在对硕大利什曼原虫(Leishmania major,L.major)易感的BALB/c小鼠免疫病理发生中的作用及机制探讨。方法以C5aR KO小鼠(BALB/c背景)为模型,观察比较了WT和C5aR KO的BALB/c小鼠在L.major感染后的病变情况,有限稀释法检测了各组感染小鼠体内寄生虫的负荷,并进一步通过FACS检测了相关细胞因子如IL-17和IL-4的产生,来探讨C5a/C5aR通路在L.major易感型BALB/c小鼠免疫病理发生中的作用机制。结果相比WT小鼠,C5aRKO小鼠感染L.major后的病变程度明显减轻(P<0.05),体内寄生虫负荷也显著降低(6.952±0.398vs 4.340±0.434,P<0.01);同时,FACS胞内染色结果表明CD4+IL-4+T细胞亚群百分比显著降低(0.960 0±0.148 3 vs0.314 0±0.042 6,P<0.01),但CD3+IL-17+T细胞亚群的百分比在两组之间无显著差异(0.792 0±0.051 3 vs 0.858 0±0.084 5,P=0.522 3)。结论 C5a/C5aR通路通过调节Th2细胞关键细胞因子IL-4的产生,在L.major易感小鼠的免疫病理发生中发挥作用。     

甲壳低聚糖对饲高糖高脂大鼠血糖的调节作用

目的观察甲壳低聚糖(COS)对注射小剂量链脲佐菌素(STZ)及饲高糖高脂大鼠血糖的影响。方法大鼠随机分为2组:正常对照组10只,喂基础饲料;造模组40只,经腹腔注射小剂量STZ后,用基础饲料喂养2周,挑选葡萄糖耐量异常者20只又随机分为2组:高糖高脂对照组10只和COS干预组10只,两组均用高糖高脂饲料喂养,同时COS干预组用COS溶液灌胃给药。各组连续观察16周,定期测定体重、空腹血糖及胰岛素水平,实验结束前通过葡萄糖耐量试验来观察胰岛β-细胞功能变化。结果 COS干预组与高糖高脂组比较,体重、空腹血糖和胰岛素水平差异显著(P<0.05或0.01),葡萄糖耐量异常得到明显改善(P<0.05)。结论 COS有降低高糖高脂饲料大鼠血糖水平,增强糖耐量的作用。     

甲壳低聚糖对2型糖尿病造模大鼠胰岛β细胞的保护作用

目的观察甲壳低聚糖(COS)对2型糖尿大鼠胰岛β细胞的保护作用。方法试验大鼠经腹腔注射STZ 2周后,挑选葡萄糖耐量异常者继续给予高糖高脂饲料喂养,同时试验组用COS灌胃给药。分别在第0、4、8、12周剪尾取血测定空腹血糖及胰岛素水平,第16周末,股动脉取血,分离胰腺并固定做HE染色和胰岛原位细胞凋亡检测。结果 COS组空腹血糖、胰岛素水平和胰岛β细胞凋亡比例明显低于模型组。结论甲壳低聚糖具有改善胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞的作用。     

过表达CXCR4/CXCR7影响人脐带间充质干细胞迁移和增殖

目的探讨SDF-1/CXCR4及SDF-1/CXCR7对人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)迁移和增殖活性的影响。方法用Ad-EASY腺病毒质粒系统分别构建表达CXCR4和CXCR7的重组腺病毒,感染h UC-MSCs后用FCM分别检测细胞膜的CXCR4和CXCR7受体的表达,Transwell法检测细胞迁移,MTT检测h UC-MSCs增殖活性,以及在H2O2诱导细胞毒性作用对细胞存活的影响。结果成功构建表达人源的CXCR4和CXCR7的重组腺病毒,感染后h UC-MSCs细胞膜上的CXCR4/CXCR7受体阳性表达率分别达到93.7%和78.5%(P0.01),高表达CXCR4和CXCR7均显著增强SDF-1诱导的h UC-MSCs细胞迁移,其中CXCR7效应稍弱;高表达CXCR7而不是CXCR4显著提高SDF-1诱导的h UC-MSCs增殖活性和氧化应激状态下的细胞存活率(P0.05)。结论 CXCR4/CXCR7均参与介导了SDF-1诱导的h UC-MSCs细胞迁移作用,同时CXCR7还介导了SDF-1诱导的h UC-MSCs增殖和H2O2处理损伤的保护。     

Wnt3a减轻黑素细胞iMC65氧化应激损伤

目的探讨Wnt3a对氧化应激损伤的i MC65黑素细胞的保护作用及机制。方法将黑素细胞分成对照组,Wnt3a组,H2O2处理组,Wnt3a干预组,750μmol/L的H2O2作用模拟黑素细胞的氧化应激损伤。MTT实验检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞产生活性氧(ROS),荧光素酶报告基因检测Nrf2/ARE通路的激活,Western blot检测Nrf2/ARE通路的相关蛋白表达。结果与对照组相比,H2O2处理组的细胞活性明显下降(P0.01),凋亡比率明显上升(P0.01),ROS的产生明显增加(P0.01)。而Wnt3a干预组能显著缓解H2O2处理组细胞活性的降低(P0.05)、降低凋亡比率(P0.05),减少ROS的产生(P0.05)。Wnt3a也能上调Nrf2和HO-1蛋白水平的表达。结论 Wnt3a可以保护氧化应激状态下的黑素细胞,其机制可能与激活Nrf2/ARE有关。