重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

CT抗原KM-HN-1 HLA-A * 0201限制性表位预测及其与HLA-A * 0201结合强度分析

目的通过对CT抗原（cancer-testis antigen）KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，并对候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合亲和力及复合物稳定性进行分析，为探索基于KM-HN-1的免疫治疗奠定基础。方法利用基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法PAProc及基于肽MHC-I结合的算法BIMAS和SYFPEITHI对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测．合成KM-HN-1相关候选表位肽KM-HN-I321-329（KLLPFRETV），KM-HN-I303-211，（FLPTAPPNV），KM-HN-I629-637。（TLLQIIETV），KM-HN-I87-95（ILNKSIIEV），KM-HN-I538-596。（QMMEALDQL）及阳性对照肽HBVcAg18-27（FLPSDFFPSV）；对这些合成肽与HIA-A＊0201分子结合亲和力及其复合物稳定性根据文献报道的方法进行分析。结果KM-HN-I321-329（KLLPERETV）结合亲和力最低，KM-HN—I203-211（FLPTAPPNV）结合亲和力最高，其余3条肽结合亲和力介于2者之间；稳定性实验（DC50）结果显示：KM-HN-I538—546（QMMEALDQL）DC50小于2h，KM—HN-I321-329（KLLPERETV）的DC50介于2～4h之间，KM-HN-I87-95。（ILNKSIIEV）的DC50介于6～8h之间，KM-HN-I233-211（HLPTAPPNV）及KM-HN-I629—633（TLLQIIETV）的DC50均大于8h。结论基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法及基于肽MHC-I结合的算法对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，结合候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合的亲和力与复合物稳定性实验分析，为该抗原HLA-A＊0201限制性表位的鉴定奠定了基础。     

人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

目的：探讨内皮细胞清除补体攻膜复合物（MAC）的途径及其清除动力学，方法：原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH414荧光标记质膜双层，0℃组装亚溶剂量的MAC，37℃复苏后，LSCM实时监MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞，胞吐情况,流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况，结果：MAC沉积后，内皮细胞有的质膜囊泡化形成，囊泡以胞吞和胞吐2种方式离开细胞，并以前者占优，37度条件下，内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为5min。结论：内皮细胞可通过胞吞和胞吐2种机制清除细胞表面沉积的MAC，并以胞吞方式为主。     

重组MHCⅠ类分子K^b-EGFP分子的构建及表达

目的 构建绿色荧光蛋白标记的MHCⅠ类分子K^b(K^b-EGFP融合蛋白)，并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法 RT-PCR的方法获得小鼠MHCⅠ类分子K^b cDNA，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP分子的上游，脂质体转染COS-7细胞，G418加压筛选获得抗性重组细胞。荧光显微镜下观测重组分子的表达及胞内定位情况。结果 分子克隆的方法获得了预期的重组质粒，质粒经DNA序列测定证实阅读框无误，转染COS-7细胞后的抗性克隆胞浆内可以观察到明亮的绿色荧光，特征性地分布于细胞质膜，及核周、膜下的囊泡结构中。结论 所构建的K^b-EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有MHCⅠ类分子的特征性分布，提示该重组分子具有野生型MHCⅠ类分子的生物学特性和胞内分布特征，为进一步深入研究MHCⅠ类分子胞内动态分布及分子功能提供了良好的细胞和分子模型。     

抗人B因子单克隆抗体的制备及其特性的初步研究

本文以人B因子免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得六株(A_2、B_2、B_7、C_9、F_9、F_(10))分泌抗人B因子单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞系。用ELISA检测细胞培养上清和小鼠腹水的特异性抗体效价,分别为10~(-2)—10~(-3)和10~(-4)—10~(-5)。抗原阻断试验结果,说明这些单抗是B因子特异的。经取代试验和ACH_(50)抑制试验,提示B因子具有耐热和不耐热二组抗原决定基。A_2和B_2针对不耐热抗原决定基,能抑制补体旁路途径活化;B_7和C_9针对耐热抗原决定基,不影响补体旁路途径活化;F_9和F_(10)则既能与耐热决定基发生反应,也具有抑制补体旁路活化的功能。用固相抗原竞争抑制试验,分析B因子的抗原表位,发现6株单抗可识别4个抗原决定基。这些单抗对B因子结构与功能的研究,B因子在补体旁路活化过程中与有关补体成分之间的相互关系的研究,都是很有意义的。     

FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒，并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增FLK1265—2493片段，将该片段插入到pMDT-18载体中后，亚克隆至真核表达载体pSG．SS．C3d3．YL，构建FLD1265-2493与C3d3融合基因表达质粒。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后，将重组质粒pSG．SS．FLK1265—2493．C3d3．YL转染Hela细胞，检测其体外表达。结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在。结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达，这为进一步的动物实验打下了基础。     

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体，将重组人绿色荧光蛋白表达载体（pAAV-IRES-GFP）外源DNA定向转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察外源基因的表达，比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1：1的比例混合转染可以得到很高的转染效率，过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。     

免疫磁珠法分离人外周血CD4+CD25+调节性T细胞

目的 建立人外周血单个核细胞中CD4 CD25 调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离力(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率.方法 采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人周血单个核细胞中的CD4 CD25 调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CIM细胞,再用抗CD25 的磁珠阳性分选CD4 CD25 T细胞.分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;内因子染色检测其转录因子FOXV3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4 CD25-T细脆殖抑制效应.结果 阴性分选CD4 T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4 CD25 Treg细胞的纯度(95.1±1.2)%.胞内因子染色FOXF3在CD4 CD25 Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%.3H-TdR掺入法检测其对CIM CD25-T细胞具有明显的抑制作用.结论 采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4 CIY25 Treg,为进一步研究其功能提供了方便.     

应用双抗体夹心ELISA检测人血清中Clq含量

本文采用抗人Clq单克隆抗体和多克隆抗体建立双抗体夹心ELISA,检测人血清中Clq含量。244份正常人血清标本检查结果,Clq正常值为287±56μg/ml。检测28份SLE患者血清有4份Clq呈明显下降.26份SLE病人血清同时用CH50试验检测总补体含量,发现二者呈正相关。因此,该技术有可能作为有关疾病如SLE等的临床诊断及疗效监测的辅助方法。