衔接蛋白p66Shc在高糖诱导的肾小管上皮细胞线粒体活性氧簇产生中的作用

目的：观察高糖环境下人近端肾小管上皮细胞HK-2中p66Shc的表达和磷酸化,以及p66Shc瞬时高表达对高糖诱导的HK-2线粒体活性氧簇产生的影响,为探讨糖尿病肾病线粒体ROS产生的机制提供新的思路。方法：常规培养正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）,将30mmol／LD-葡萄糖在不同时间点作用于体外培养的HK-2细胞,采用Real—time—PCR检测p66ShcmRNA的表达变化,Western blot检测p66Shc蛋白、磷酸化p66Shc—Ser36蛋白的表达;进一步将pcDNA3．1hisp66Shc质粒转染HK-2细胞,采用激光共聚焦显微镜观察p66Shc高表达对高糖诱导的线粒体活性氧簇产生的影响。结果：30mmol／LD-葡萄糖能呈时间依赖性上调p66ShcmRNA和蛋白表达水平,同时增强p66Shc第36位丝氨酸的磷酸化;在30mmol／LD-葡萄糖作用下,转染p66Shc的HK-2线粒体ROS水平明显高于未转染组及空载体转染组（P〈0．05）。结论：p66Shc参与了高糖诱导的线粒体活性氧簇的产生,可能在糖尿病肾病早期肾小管氧化损伤过程中发挥重要作用。     

EMT在腹膜纤维化中的作用及意义

腹膜透析是终末期肾衰竭患者的主要替代治疗方法之一,具有操作简便、不需依赖机器等优点。长期腹膜透析患者可能发生腹膜炎、腹膜纤维化等并发症,导致腹膜超滤功能和转运功能的障碍,是制约腹膜透析发展的主要原因。近期关于上皮细胞间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的研究为我们提供了新的突破口。本文就腹膜上皮细胞的转分化在腹膜纤维化中的作用作一综述。     

16年腹膜透析的基础和临床研究回顾

总结16年以来中南大学湘雅二医院肾内科腹膜透析的基础与临床研究的经验与成果。在国内率先成功构建了腹膜透析及腹膜纤维化动物模型,分离、鉴定了腹膜间皮细胞;利用细胞、分子生物学方法,系统研究了腹膜透析液的生物相容性、腹膜间皮细胞透析损伤的分子机制与防治措施,观察了促纤维化细胞因子转化生长因子-β1(TGF-β1),结缔组织生长因子（CTGF）及过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ)等在腹膜纤维化发病机制中的重要作用,并初步阐明了它们的基因表达调控机制。首次在腹膜透析研究领域中利用纳米载体介导TGF-β1-shRNA与pCTGF-shRNA质粒在腹膜细胞与组织中的表达。在临床研究方面,研究了腹膜透析置管定位新方法、腹膜透析溶质转运特点及其机制、腹膜透析治疗模式及其他并发症的防治。     

中国特发性膜性肾病患者长期预后及危险因素分析

目的:特发性膜性肾病(IMN)是成人肾病综合症最常见的病因之一,其病程进展缓慢。虽然普遍认为IMN患者在亚洲人群的预后相对良好,但目前尚无中国大规模IMN患者长期预后的分析资料。方法:由南京军区南京总医院全军肾脏病研究所MN数据库中提取自1990至2005年间肾活检患者,并排除继发性及合并其他影响预后因素,选取随访时间>2年的IMN患者,进行临床及病理指标与预后相关性分析。结果:总计217例IMN患者入选,活检时年龄19～83岁,男性占58.5%。肾活检后5年、10年及15年肾生存率分别为96.8%,93.0%及85.5%。生存分析显示,活检时有血压升高(P<0.05)以及血肌酐升高(>109.6μmol/L,P<0.01)的患者预后较差。单因素Cox回归分析显示:临床指标中高血压,年龄>50岁及活检时即有血肌酐升高均为患者终末期肾功能衰竭(ESRF)的高危因素;病理指标中肾小管间质慢性病变重为ESRF的高危因素。多因素Cox回归分析显示活检时肾功能衰竭以及肾小管间质慢性病变重为IMN患者ESRF的独立危险因素。依患者蛋白尿转归不同进行分组,作生存分析显示尿蛋白持续不缓解患者ESRF风险明显增高,而尿蛋白部分缓解与完全缓解的患者之间预后无明显差异。结论:IMN在中国人群中预后相对良好,活检时即出现肾功能不全以及病理上肾小管间质慢性化病变分级较高为IMN患者出现ESRF的独立危险因素。治疗后出现尿蛋白缓解的患者预后相对较好。     

腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征

目的 建立从腹膜透析(PD)流出液中分离、培养人腹膜间皮细胞(HPMC)的方法,并检测上皮黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白claudin-1及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平.方法 从25例持续不卧床腹膜透析(CAPD)患者PD流出液中分离HPMC,并在体外进行原代培养.根据开始透析的时间分为新开管组(10例)和透析半年以上组(15例).采用倒置相差显微镜、免疫组织化学染色和扫描电镜对培养的细胞进行鉴定;采用实时定量PCR检测细胞E-cadherin、claudin-1及α-SMA mRNA表达.结果 22例患者(新开管组10例,半年以上组12例)PD流出液分离的细胞在体外培养成活,经鉴定均具有HPMC的特征.实时定量PCR结果显示,半年以上组较新开管组分离的HPMC细胞E-cadherin、claudin-1 mRNA表达降低,α-SMA mRNA表达增高(P<0.05),提示出现了间充质细胞转分化(EMT).结论 该研究成功建立了PD流出液分离培养原代HPMC的方法,并证实长期PD患者HPMC存在EMT倾向.该研究的发现为进一步研究腹膜纤维化(PF)和超滤衰竭(UFF)提供了新的方法与实验依据.     

microRNA与慢性肾脏疾病上皮-间质细胞转分化的研究进展

microRNA(miRNA,miR)是近年来发现的一组长度约22个核苷酸的非编码小RNA,广泛存在于病毒、动植物及人类体内,具有保守性、基因集簇现象和特异性表达[1].目前已鉴定的miRNA超过700种,仅占人类基因组序列的1%～3%,却参与1/3基因表达的调控,在生长发育,细胞分化、增殖、凋亡,肿瘤发生等过程中发挥重要作用[2].     

腹膜透析引流液离心法和大网膜消化法原代培养人腹膜间皮细胞

[目的]建立和改善两种人腹膜间皮原代细胞培养的方法.[方法]分别采用离心法从腹膜透析（PD）引流液中及胰蛋白酶-EDTA消化法从人的腹膜组织中分离培养人腹膜间皮细胞（HPMC）,并分别对两种原代培养的HPMC采用相差倒置显微镜和免疫组化染色对培养的细胞进行鉴定.[结果]①两种方法均在体外原代培养成活,在相差倒置显微镜下观察细胞均呈典型的铺路石样外观,免疫组化显示两种方法培养的HPMC胞浆角蛋白、波形蛋白表达阳性,提示为腹膜间皮细胞.②经大网膜消化法获得的HPMC可传至第四代,保持原有铺路石样外观,PD引流液离心法获得的HPMC传代后生长缓慢,长期接受PD后HPMC可呈现成纤维细胞样改变.[结论]成功应用离心法和消化法进行HPMC原代培养,有助于PD研究体外实验的开展.