肺炎链球菌表面蛋白A诱导人中性粒细胞生产CXCL8的机制

目的 研究肺炎链球菌表面暴露的毒性表面蛋白A(PspA)促进CXCL8分泌的可能机制.方法 使用炎症相关的信号分子NF-KB、p38MARK、ERK、JNK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,观察PspA对CXCL8分泌作用的影响.从受PspA刺激的人嗜中性粒细胞中分别提取细胞总蛋白和细胞核提取物,用ELISA法测定p38MAPK蛋白的活力和NF-κB的浓度的改变,并且采用Western blot方法进一步验证PspA对p38MAPK和IkB-α蛋白磷酸化水平的影响.结果 使用NF-κB,p38MARK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,可以扭转PspA促中性粒细胞分泌CXCL8的现象;而ERK,JNK的抑制剂无此效果.另一方面,PspA可以上调中性粒细胞中的P38 MAPK蛋白的含量和NF-κB的浓度,也可以提高p38MAPK和NF-kB通路抑制蛋白IkB-α的磷酸化水平.结论 肺炎链球菌PspA诱导人体中性粒细胞释放CXCL8受p38蛋白和NF-kB途径的调控.     

肺炎链球菌蛋白质疫苗研究进展

肺炎链球菌是引起肺炎、中耳炎、脑膜炎等的重要致病菌。目前投入使用的荚膜多糖疫苗有很大的局限性，因此针对其主要毒力因子的蛋白质疫苗发展很快，有望替代多糖疫苗。     

ClpP粘膜免疫预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症

目的:肺炎链球菌毒力蛋白ClpP鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠,探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值.方法:利用制备的ClpP多克隆抗体,分析ClpP 在肺炎链球菌表面表达情况;ClpP蛋白粘膜免疫小鼠,TIGR4型肺炎链球菌分别经腹腔和鼻腔攻击,分析肺炎链球菌小鼠肺内定植情况并监测小鼠生存时间.结果:流式细胞技术证实了TIGR4肺炎链球菌表面表达ClpP毒力蛋白,粘膜免疫ClpP可以特异产生系统性和粘膜性的ClpP抗体,并可减少TIGR4肺炎链球菌在小鼠肺内的定植,延长小鼠生存时间.结论:ClpP粘膜免疫可预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症,进一步证实ClpP蛋白可作为肺炎链球菌的候选蛋白疫苗.     

HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响

目的 利用腺病毒表达系统,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白对HepG2细胞增殖、Wnt1以及microRNA152(miR-152)表达水平的影响.方法 通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-HCV core,分别感染HepG2细胞后,通过RT-PCR和Western blot证实HCV核心蛋白在HepG2细胞中高效表达.MTT法、细胞周期测定和克隆形成实验检测HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响.SYBR探针荧光定量PCR和Western blot检测的HepG2-HCV core细胞中Wnt1和miR-152表达的变化.用miR-152 inhibitor转染HepG2细胞后,SYBR探针荧光定量PCR、Western blot检测HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达水平变化.结果 Ad-GFP和Ad-HCV core腺病毒经HEK293扩增后滴度分别为1.5×109 pfu/mL和1.6×1010pfu/mL.Ad-HCV core腺病毒感染HepG2细胞后,HCV核心蛋白高效表达.感染48 h后,与HepG2-Mock细胞相比,Ad-HCV core可显著促进HepG2细胞增殖(P＜0.05),加快G1/S细胞周期进展(P＜0.05),并促进细胞克隆形成(P＜0.05).Ad-HCV core腺病毒感染可在显著上调HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达量(P＜0.05)的同时下调miR-152表达水平.同时,miR-152 inhibitor可显著上调Wnt1 mRNA和蛋白水平.进一步生物信息学分析显示,Wnt1基因mRNA 3'-UTR含有miR-152结合位点.结论 HCV核心蛋白可能通过抑制miR-152而减弱其对Wnt1 mRNA的降解及翻译阻碍作用,进而达到上调Wnt1致Wnt信号通路激活,促进肝癌细胞增殖的效应.     

颗粒蛋白前体通过CTLA4调控调节性T细胞的发育和功能

目的探讨颗粒蛋白前体(PGRN)对调节性T细胞发育和功能的影响及分子机制。方法在野生型和PGRN敲除小鼠模型中,采用流式细胞术检测小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞各亚群的比例及调节性T细胞比例及其功能相关分子的表达;采用RT-PCR检测调节性T细胞中CTLA4的表达;最后采用调节性T细胞体外抑制试验验证其功能变化。结果与野生型小鼠相比,PGRN敲除小鼠脾脏、胸腺和淋巴结中调节性T细胞的比例均升高,特别发现在脾脏调节性T细胞中CTLA4在基因和蛋白表达水平均显著升高。体外功能试验发现PGRN敲除小鼠的脾脏调节性T细胞的抑制功能也较野生型增强。结论 PGRN在调节性T细胞的发育和功能中扮演重要角色,其机制可能涉及CTLA4。     

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

NLS-RARα与ISCA1相互作用在哺乳动物细胞中的验证

目的：利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术验证铁硫簇组装蛋白1（ISCA1）与带核定位信号的维甲酸受体α（NLS—RARα）蛋白间的相互作用．方法：构建含融合蛋白的真核表达载体pCMV—HA—NLS—RARα和pCMV—Myc—ISCA1,酶切及测序鉴定正确后,转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术进一步证实二者之间的相互作用．结果：真核表达载体成功构建并经测序鉴定,转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA—NLS—RARer相互作用蛋白复合物后,用抗MycmAb进行蛋白印记检测,可以检测到Myc-ISCA1蛋白的表达．结论：分别成功构建了含HA—NLS—RARer与Myc—ISCA1融合蛋白的真核表达载体,并利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术在体外证实了NLS—RARα与ISCA1之间存在相互作用．     

IL-27诱导人成纤维样滑膜细胞产生IL-6的免疫机制

目的：探讨白介素-27（interleukin-27,IL-27）对人成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）的体外活化效应及细胞内信号传导机制。方法：IL-27处理FLS后,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6,IL-6）水平的变化;信号通路抑制剂处理FLS后1 h,用IL-27刺激FLS 48 h,ELISA检测细胞上清液中IL-6的水平变化;Western blot检测IL-27刺激FLS不同时间细胞内信号通路蛋白的磷酸化水平。结果：IL-27能刺激正常关节来源的FLS（N-FLS）和RA患者关节来源的FLS(RA-FLS)产生IL-6,IL-27（50 ng/mL）刺激N-FLS产生的IL-6水平[（1329.10±113.15） pg/mL]和刺激RA-FLS产生的IL-6水平[（1 583.70±129.54） pg/mL]较其阴性对照明显升高（P=0.001,P=0.001）。用不同浓度（0、10、20、50、100 ng/mL）IL-27分别处理2种细胞不同时间（0、12、24、48 h）,产生IL-6的水平随浓度和时间增加而升高,具有时间和剂量依赖性。JAK抑制剂AG490和JNK抑制剂SP600125可显著抑制IL-27诱导N-FLS和RA-FLS产生IL-6。IL-27刺激N-FLS和RA-FLS后,细胞内信号通路蛋白JAK2和JNK的磷酸化水平明显升高（JAK2：F=303.000,P=0.000;F=640.400,P=0.000;JNK：F=98.840,P=0.000;F=54.820,P=0.001）。结论：IL-27可通过激活FLS细胞内JAK2和JNK信号通路上调FLS产生IL-6水平,从而增强关节滑膜的炎症反应。     

肺炎链球菌表面蛋白C诱导人嗜中性粒细胞分泌IL-8的机制研究

目的研究肺炎链球菌表面暴露的毒性表面蛋白C(PspC)促进IL-8分泌的可能机制。方法使用炎症相关的信号分子NF-κB,p38MARK,ERK,JNK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,观察PspC对IL-8分泌的影响。从受PspC刺激的人嗜中性粒细胞中分别提取细胞总蛋白和细胞核提取物,用ELISA法测定p38MAPK蛋白的活力和NF-κB的浓度,并且采用Western blot方法验证PspC对p38MAPK和IκB-α蛋白磷酸化水平的影响。结果使用NF-κB及p38MARK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,可以扭转PspC促中性粒细胞分泌IL-8的现象;而ERK和JNK的抑制剂无此效果。同时,PspC可以上调中性粒细胞中的P38MAPK蛋白的含量和NF-κB的浓度,也可以提高p38MAPK和NF-κB通路的抑制蛋白IκB-α蛋白磷酸化水平。结论肺炎链球菌PspC诱导人体中性粒细胞释放IL-8受p38MAPK和NF-κB途径的调控。