HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性测定系统的研究进展

NS3/4A丝氨酸蛋白酶是理想的抗HCV靶位之一.缺乏有效的细胞培养系统和小动物模型是抗HCV药物筛选和评价的瓶颈,基于酶建立的测定系统常被用作筛选和鉴定抗HCV药物.关于NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的测定系统已经有很多报道,本文从细胞内测定和体外测定系统两方面综述如下.     

突变型天花粉蛋白TCSYFF81-83ACS的生物活性及免疫原性分析

目的:构建一种突变型天花粉蛋白(trichosanthin,TCS),并对其生物活性和免疫原性进行分析。方法:选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83)进行定点突变,并将所构建的突变体(TCSYFF81-83ACS)在大肠杆菌中进行表达及纯化。随后与野生型TCS(wTCS)比较,分析其DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性和急性毒性。结果:初步检测显示,所构建的突变型TCS活性与wTCS活性几乎相当,而其免疫原性有所降低。结论:通过该方法改造TCS是可行的,有可能为抗HIV治疗提供一种高效、低毒、廉价的药物。     

汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化

目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。     

CCHFV S基因的重组杆状病毒的构建及鉴定

目的　利用杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector systems, BEVS）构建含有克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）S基因的重组杆状病毒,并在sf9昆虫细胞中表达出核衣壳蛋白（nucleoprotein, NP）。方法　将合成的CCHFV S基因定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac? Dual,获得重组的转移载体pFastBac? Dual-CCHFV-S。将其转化到E. coli DH10Bac?感受态细胞中,筛选得到重组杆状病毒杆粒rBV-Bacmid-S。用Cellfectin? II试剂将rBV-Bacmid-S转染入sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-CCHFV-S。通过IFA和Western blot检测CCHFV S基因的表达。结果　构建了含有S基因的rBV-CCHFV-S,在sf9昆虫细胞中成功表达CCHFV NP。结论　利用BEVS 可以成功表达CCHFV NP,这为研究CCHFV NP的生物学特性,研制特异性的治疗药物和预防控制疫苗奠定基础。     

乙脑病毒 E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

目的:构建乙脑病毒(JEV)E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法:采用RT-PCR扩增片段,定向克隆入pET28a( )中;重组载体pET28a-6His-E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS-PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达;表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化. 结果:构建得到原核融合重组载体pET28a-6His-E;诱导后表达得到6His-E融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论:表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.     

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的：构建天花粉蛋白（TCS）突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法：借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇（YFF81-83）并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot鉴定。最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果：成功构建了TCS突变体（TCSYFF81-83ACS）,并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

聚合酶链反应在腺病毒角结膜炎诊断中的应用

设计合成多聚合酶链反应（PCR）通用引物，结合限制性片段长度多态性（RFFL）分析，建立了腺病毒性角结膜炎的检测方法，初步应用于急性角结膜患者眼拭子标本的检测。     

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的：构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒，并获得NS5B蛋白的高效表达，为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件。方法：利用PCR技术扩增HCV ns5b基因，Xho I和Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上，转化大肠杆菌JM109菌株，获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b，阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定，并以薄层扫描分析对其定量。结果：成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b，经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白25％，Western—Blot结果显示表达蛋白保持活性。结论：HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达。     

抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因的克隆与鉴定

目的 克隆抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区（VH）基因.方法 从分泌抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,挑取菌落PCR鉴定后测序并进行分析.测序正确的质粒经EcoRI和XhoI酶切、纯化后的产物和原核表达载体pRSET A在SolutionI作用下连接,转化BL21（DE3）对重组质粒进行表达.经Tricine-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重链可变区表达产物的表达水平,用ELISA检测表达产物能否与日本脑炎病毒结合.结果 确定了2F2VH基因序列,长度为354 bp,编码118个氨基酸,第22位和第96位残基是维持抗体结构的半胱氨酸,含有特异性CDR1、CDR2和CDR3区域,符合鼠源性免疫球蛋白基因的特征.ELISA检测结果显示原核表达的2F2重链可变区产物可与日本脑炎病毒特异性结合.结论 获得了抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因.     

鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链町变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达.方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAH scFv基因.将测序正确的scFv基因克隆入pHEN 1载体,并利用E.coli HB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAH VH-linker-VL scFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744 bp,编码248个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,pHEN 1-anti-HAAH在E.coli HB2151可表达为Mr约27 000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%.间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAH scFv蛋白具有较高的抗原结合活性.结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAH mAb VH区和VL区基因,并构建为anti-HAAH scFv基因.然后,利用pHEN 1载体对anti-HAAH scFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.