抗血管生成肿瘤疫苗研究进展

研究发现,肿瘤的生长和转移依赖于血管的生成,如果抑制肿瘤新生血管的形成就可以有效抑制肿瘤细胞的生长和转移.越来越多的证据表明,以血管相关抗原为靶点的疫苗可以引发机体产生特异性细胞或体液免疫反应,抑制血管的形成,从而起到阻止肿瘤细胞生长和转移的作用.目前,针对肿瘤血管生成的疫苗治疗已成为肿瘤研究的热点及肿瘤治疗的新策略.本文就目前所进行的抗肿瘤血管生成的疫苗研究情况作一综述.     

佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎(RA)动物模型；从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞(FLS)。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎；剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似；成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。     

稳定表达hTERT/Luc的小鼠黑色毒瘤肺转移模型的建立

目的 建立稳定共表达荧光素酶基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并通过尾静脉注射的方式建立小鼠肿瘤肺转移模型.方法 利用DNA重组技术将hTERT基因和荧光素酶基因Luc定向插入到真核表达载体,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000共转染小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418及潮霉素B加压筛选出稳定转染的细胞株.应用Western blot法及免疫荧光法检测hTERT和Luc基因在B16细胞中的表达;将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠建立肿瘤肺转移模型,并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长.结果 建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc,经检测hTERT基因和荧光素酶基因Luc在单克隆细胞株中的表达分别为84％和98％.通过尾静脉注射的方式成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型,应用活体成像技术能方便地检测到B16-hTERT/Luc肿瘤在小鼠体内的生长情况.结论 成功建立了可用于活体成像技术检测的稳定表达hTERT的小鼠黑色素瘤肺转移模型.     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

异种化PSCA融合基因抗前列腺癌DNA疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的DNA疫苗（pVAX1-PSCA3-Fc—GPI—IRES—GM／B7,简称pVAX1—PSCA3FcGB）,并在Cos7细胞中表达。方法：重叠延伸PCR合成异种化PSCA基因片段,同尾酶法将该片段3拷贝串联（PSCA,）后插入pCI—Fc—GPI载体中,再将PSCA3-Fc—GPI融合基因片段经酶切后导人真核表达载体pVAX1-IRES—GM／B7中,构建pVAX1-PSCA3FcGB疫苗,并检测其真核表达情况。结果：经测序异种化PSCA片段与设计一致,PCR和酶切鉴定证明pVAX1-PSCA3FcGB构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪检测结果显示,该疫苗在Cos7细胞中获得较好表达。结论：成功构建DNA疫苗pVAX1-PSCA3FcGB,并在Cos7细胞中有效表达,为下一步的DNA疫苗功能研究奠定了重要基础。     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原（PSCA）真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12（hIL12）双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。     

锚定修饰的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI的构建及鉴定

目的为研究锚定修饰的rmCGβ-IgGFc-GPI的新功能和免疫治疗奠定基础。方法应用基因工程技术将pCI-IgGFc-GPI质粒经双酶切后,插入pcDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Ig-GFc-GPI,然后再插入经双酶切的恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基（rmCGβ亚基）,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,流式细胞仪技术和细胞免疫荧光法检测B16细胞中表达的IgGFc段融合蛋白。结果酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI,流式细胞仪技术和细胞免疫荧光法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达目的蛋白;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI。结论锚定修饰的rmCGβ亚基的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI成功构建,且能在B16细胞内表达;为进一步研究锚定修饰的rmCGβ-IgGFc-GPI的新功能和免疫治疗奠定了基础。