人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定

目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。     

高迁移率族蛋白B1真核表达载体的构建及其对肿瘤坏死因子-α报告基因活性的影响

目的克隆人的高迁移率族蛋白B1（HMGBl）基因，插入pc-DNA3载体中并检测其对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）报告基因活性的影响。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术，从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出HMGBl基因，插入载体pe-DNA3中，确定所扩增的DNA序列；用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）在293T细胞中检测其表达；应用报告基因方法检测其对TNF-α报告基因表达的影响。结果酶切和测序结果表明扩增的HMGBl序列正确，大小为648bp。在293T细胞中正确表达相对分子质量约24000的HMGBl蛋白。下游基因TNF-α荧光素酶活性实验显示，构建的真核表达载体在内毒素刺激后以先增加后降低的方式影响TNF-α的活性，且对从95-120长度的TNF-α报告基因活性影响最明显。结论HMGBl以先增加后降低的方式影响TNF-α基因的表达，且主要通过26个碱基大小的片段发挥作用。     

在多孔胶原支架上构建三维工程的心肌组织

背景：目前已有转化的SV40细胞系、C2C12成肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及胚胎干细胞用于修复哺乳动物心脏的细胞移植治疗，然而细胞移植治疗对严重缺失或损伤心肌结构的治疗的作用却不大。组织工程技术为此类心肌疾病的研究及治疗提供了新的可能性，目前已有可替代和改善骨、软骨、肾、肝、神经及皮肤等组织和器官的生物合成结构物。目的：探索多孔胶原作为构建三维工程心肌组织支架材料的可行性。设计：非随机、对照的实验研究。地点和对象：实验地点：军事医学科学院生物工程研究所。动物：清洁级1日龄Wistar大鼠400-500只，雌雄不限，体质量8～10g；成年Wistar大鼠五六只，雌雄不限，体质量250g，由军事医学科学院实验动物中心提供，饲养温度22～26℃，湿度40％～60％。干预：在无菌条件下，将经胰蛋白酶消化获得的新生鼠心肌细胞分别接种于三维多孔胶原支架和培养板上，比较心肌细胞在两种培养模式的代谢差异。主要观察指标：检测葡萄糖比消耗率、乳酸比产率、乳酸转化率、肌酸激酶及乳酸脱氢酶活力变化。结果：培养于多孔胶原支架上的心肌细胞的代谢特性近似于心肌细胞在培养板上培养的二维生长模式。结论：心肌细胞与多孔胶原支架形成了具有自律性同步收缩的三维工程心肌组织，多孔胶原作为心肌组织工程的支架材料有良好的应用前景。     

囊虫病诊断用抗原核糖体P蛋白的克隆和表达

目的：克隆并表达了囊尾蚴相对分子量为13000D的核糖体P蛋白，期望利用此蛋白用做临床诊断试剂盒。方法：利用总RNA提取试剂盒得到囊尾蚴基因组总RNA，而后采用反转录PCR的方法，从囊尾蚴基因组中扩增得到366bp的DNA片段，将其连接于T载体上，测序正确后克隆到表达载体pUC18上，将pUC18-P重组质粒转入E.coliDH5a，用ITPG诱导表达出目的蛋白。结果：获得分子大小为13000D的蛋白。结论：经克隆和表达的该蛋白可被用作一种诊断性抗原。     

不同灭菌方法对脱乙酰几丁质性质的影响

实验表明，经１１５℃压力蒸汽灭菌后，脱乙酰几丁质的分子量、粘度及其与海藻酸钠交联形成的膜强度均变化较小；经γ射线照射或环氧乙烷灭菌者则变化较大。     

肉毒毒素防治药物的研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性最强的蛋白质,可以引发严重的突发公共卫生事件,也是重要的生物战剂和生物恐怖剂,因此迫切需要研制医学防治药物以应对其威胁。本文概述了国内外在肉毒毒素预防性疫苗和治疗性中和抗体防治药物研发进展,同时分析了肉毒毒素防治药物的新趋势和今后的主要发展方向。     

1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA(small interfering RNA)1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

新型HIV-1 gp41融合抑制剂CP32M的构效关系研究

目的研究新型融合多肽CP32M中VEWNEMT序列的长短、残基的极性及其他部位残基的极性对其抑制gp41融合活性的影响。方法在多肽CP32M的基础上,通过对前7个氨基酸序列进行截取、部分替换、全部替换及改变其他位置氨基酸残基的极性设计合成系列多肽,测定多肽抑制HIV-1融合活性。应用圆二色谱、分子排阻色谱测定多肽与N36的结合功能。结果截取、替换氨基酸后的肽抑制gp41融合的活性都不同程度降低,与N36结合形成六束螺旋的能力减弱。在CP32M中部及C端i与i+4位置引入Lys增加Glu-Lys离子对作用后,肽活性降低。用C34的C端氨基酸序列NEKDLLE及可与gp120结合的序列RINNIPWSEAM置换QIWNNMT后,多肽仍有很高活性。结论片段VEWNEMT是关键片段,其中VE及MT是关键功能氨基酸。其他片段替代该片段后仍有较强活性,也与N36形成螺旋结构,提示该片段含有共性结合区。     

PC-1基因功能研究：PC-1蛋白兔多克隆抗体制备的改进和应用

目的：获得高效价PC-1蛋白的兔多克隆抗体，用于PC-1功能的实验。 方法：实验于2004-02／08在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。以纯化后的PC-1蛋白及其N端46个氨基酸与GST的融合蛋白（GST—PC-1和GST-PC-1-46）为抗原，通过一种经腘淋巴结注射、免疫家兔的改进的免疫方法制备兔多克隆抗体。应用ProteinA亲和层柝纯化抗体。以酶联免疫吸附和Western-blot及免疫组化法鉴定所得抗体。 结果：①2个兔多克隆抗体的效价分别为1：12800和1：51200。②PC-1在高恶性前列腺癌细胞C4—2中高表达，在低恶性前列腺癌细胞LNCaP中有少量表达。③经免疫组化染色后，含有PC-1蛋白的C4—2及LNCaP细胞均呈阳性反应，细胞质中可见明显着色，而空泡状的胞核则没有着色，提示PC-1蛋白主要分布在细胞浆中。结论：用一种改进的免疫方法，获得高效价的、可应用于酶联免疫吸附和Western—blot及免疫组化实验的PC—1蛋白兔多克隆抗体。