乙型肝炎病毒PreS1抗原的研究进展

HBV是部分双链的DNA病毒,病毒基因组约3.2 kb大小,结构紧密,含有S,C,P和X四个开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别编码外膜蛋白、核壳蛋白、DNA多聚酶和X蛋白[1].HBV病毒吸附蛋白存在于病毒包膜的3个相关蛋白:大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)和主蛋白(SHBs),3种蛋白C端有相同的序列,主蛋白由S基因编码,226个氨基酸组成;中蛋白由S及pre-S2基因区编码,281个氨基酸组成;     

重组抗原CP4-EPSPS的表达及免疫学活性研究

目的：表达并纯化重组CP4-EPSP合成酶（CP4-EPSPS），研究重组CP4-EPSPS的免疫学活性；为进一步制备单克隆抗体和开发检测CP4-EPSPS的快速诊断试剂奠定基础。方法：诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS的重组载体pET-EPSPS。经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化，以ELISA、胶体金试条、Western杂交鉴定其免疫活性。结果：重组CP4-EPSPS以包涵体表达为主，上清表达量极低，但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS抗原活性强；复性包涵体的抗原性与上清的抗原性明显不同。采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法，从上清中纯化CP4-EPSPS获得成功，ELISA检测此重组抗原免疫小鼠血清抗体滴度可达到1：625，000；Western杂交证实重组抗原免疫血清与CP4-EPSPS标准品有较好的免疫反应性。结论：包涵体的简单复性方法难以恢复其关键的抗原决定簇的免疫原性；运用胶体金试纸条检测重组CP4-EPSPS活性，灵敏度高，简单快捷，对CP4-EPSPS特异检测相关的关键性抗原决定簇的甄别有重要作用，可指导重组抗原的纯化和在免疫学研究、特别是在单克隆抗体开发中的应用。     

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

靶向COX-2的siRNA抑制三种不同分化程度胃癌细胞生长及作用机制

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在体外抑制COX-2表达,研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞(MKN-28,SGC-7901,BGC-823)的可能性,探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6 1-siRNA-COX-2并导入胃癌细胞株,体外诱导RNAi,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blotting检测COX-2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记(TUNEL)及透射电镜检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的改变. 结果:pTZU6 1-siRNA-COX-2质粒导入细胞后,SGC-7901和BGC-823中COX-2表达明显下调,细胞生长被抑制,并出现特征性的细胞凋亡,同时有Bax蛋白上调和Bcl-2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论:RNAi显著抑制胃癌细胞生长,可能与下调COX-2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著,提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.     

三七总皂甙对抗大鼠免疫性肝纤维化的实验研究

目的 进一步观察三七总皂甙抗大鼠免疫性肝纤维化的作用。方法 用牛血清白蛋白等复合因素致大鼠肝纤维化，同时给予三七总皂甙60mg／kg和30mg／kg皮下注射治疗，共6周。分离血清，检测肝功能；分离肝组织，作病理学纤维化程度分级和免疫组化观察Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF—B，的合成表达。结果 三七总皂甙能降低血清转氨酶，增加肝脏白蛋白的合成，减轻肝纤维化程度，抑制免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF—β1的合成表达。结论三七总皂甙具有抗肝纤维化作用。     

金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的研究现状

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是常见致病菌,其表面蛋白质在感染宿主过程中发挥重要作用,其中SdrE蛋白质为其表面蛋白质之一,研究发现 SdrE蛋白质的表达几乎不受环境因素（包括温度、金属离子）的影响,并且可能与S.aureus对甲氧西林的抵抗力有关,近年来发现SdrE蛋白质的磷酸化直接影响了S.aureus的毒性,同时,SdrE蛋白质能够通过黏附补体调节因子H来逃避宿主免疫反应,并且还能够独立诱导血小板发生聚集,已经发现SdrE蛋白质能够在骨骼感染、关节感染以及骨髓炎中发挥重要作用。本文主要分析了SdrE蛋白质的生物学功能,为基于SdrE蛋白质的新的特异性抗菌药物的开发指明方向和提供理论基础。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

肿瘤特异性Survivin启动子与甲胎蛋白启动子的活性评价与比较

目的研究并比较肿瘤特异性Survivin和甲胎蛋白(AFP)基因启动子在不同肝细胞癌细胞系中的转录活性，为肝癌靶向性基因治疗提供依据。方法采用聚合酶链反应法扩增获得Survivin和AFP基因的启动子片段，并克隆入表达虫荧光素酶基因的报告质粒中，通过测定荧光素酶报告基因的表达情况，测定Survivin与AFP基因启动子的转录活性，同时采用巨细胞病毒启动子为对照，评价其转录活性水平。结果Survivin启动子在肝癌细胞中具有相当强的活性，其活性水平在高表达AFP的肝癌细胞中为AFP启动子的54～100倍，达到巨细胞病毒启动子活性的16％～21％。结论Survivin启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性，可望开发成为新的肝癌靶向性基因治疗工具。     

siRNA腺病毒抑制Survivin基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的为改进质粒siRNA载体的不足,建立siRNA的病毒性载体系统,并探讨凋亡抑制因子Survivin基因在肝癌细胞中的作用。方法通过已建立的Survivin质粒siRNA,构建Survivin的腺病毒siRNA载体系统,筛选重组病毒并感染肝癌细胞HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Survivin基因表达变化,用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡。结果成功构建Survivin基因的腺病毒siRNA载体及重组腺病毒,感染肝癌细胞明显抑制Survivin蛋白表达,抑制率66.32%;降低Survivin基因的mRNA转录水平达72.04%;应用流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡明显增加。结论腺病毒siRNA载体系统可作为抑制目的基因,进而研究其功能和作用的技术平台,并为其他基因的相关研究打下基础;抑制Survivin基因表达可诱导肿瘤细胞HepG2的凋亡,为今后腺病毒siRNA载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

骨化三醇对晚期糖基终末产物诱导的NRK52E细胞EMT的影响

目的 探讨骨化三醇对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导的肾小管上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及可能机制.方法 先单独用骨化三醇刺激细胞,再采用AGEs处理NRK52E细胞,建立由AGEs诱导的细胞EMT模型.分为4组:对照组、模型组、低剂量骨化三醇(10nmol/L)预处理的模型组、高剂量骨化三醇(100nmol/L)预处理的模型组.利用Western blot、逆转录实时定量PCR等方法检测E-cadherin、α-SMA、AGEs特异性受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)及NF-κB的磷酸化等的表达.结果 骨化三醇单独刺激时,大鼠肾小管上皮细胞上的E-cadherin和α-SMA的表达未发生明显变化;较对照组,AGEs培养后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著下调,α-SMA表达明显上调,AGEs特异性受体显著表达增多,NF-κB途径活化;以上变化都能够被骨化三醇所逆转(P＜0.05),抗RAGE中和抗体(AF1616)可抑制AGEs引起的E-cadherin下调和α-SMA上调,骨化三醇抑制AGEs诱导RAGE的上调能够被NF-κB磷酸化抑制剂(IMD0354)部分阻断.结论 骨化三醇通过降低RAGE的表达和阻断NF-κB的磷酸化来抑制肾小管上皮细胞上皮间质转化.