Api6在高脂高胆固醇饮食引起肺部炎症中所发挥作用的研究*

 目的：研究凋亡抑制因子6（Api6）在高脂高胆固醇饮食所致C57BL/6J小鼠肺部炎症反应中的作用。方法：6～8周龄的C57BL/6J雄性小鼠喂养于SPF环境中,随机分成2组,分别给予普通饮食和高脂高胆固醇饮食喂养。喂养16周后收集肺组织并采用免疫组织化学和ELISA法鉴定肺组织的炎症状态。实时定量PCR和Western blotting鉴定Api6 mRNA与蛋白的表达水平,流式细胞术检测小鼠支气管肺泡灌洗液细胞凋亡情况。体外培养巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术检测Api6对氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）引起的细胞凋亡的影响。结果：高脂高胆固醇饮食喂养小鼠16周后,C57BL/6J小鼠肺组织出现以巨噬细胞蓄积以及肿瘤坏死因子α和单核细胞趋化蛋白1升高为主的炎症反应。与普通饮食组相比,高脂高胆固醇饮食喂养小鼠肺组织的Api6 mRNA和蛋白表达水平都显著上调（P<0.01）,同时支气管肺泡灌洗液中的巨噬细胞凋亡水平明显下降（P<0.01）。体外实验证实500 μg/L的重组Api6处理RAW264.7细胞可显著抑制oxLDL引起的细胞凋亡（P<0.05）。结论：高脂高胆固醇饮食可致C57BL/6J小鼠肺组织巨噬细胞蓄积,其机制可能与Api6抑制巨噬细胞的凋亡有关。     

RNA干扰技术用于肝病治疗的研究

近年来，病毒性肝炎的治疗研究有了长足的进展，特别是干扰素和抗病毒核苷类药物不断有新的发现，但其疗效仍有不尽人意之处。随着人类基因组计划的完成，基因治疗的领域不断拓展，抗病毒性肝炎及相关肝病的基因治疗研究又有了相应的发展，其中RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现为病毒性肝炎抗病毒治疗研究提供了新的选择。     

HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X pro－tein,HBx）特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA 亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乙型肝炎病毒复制的影响

目的：研究SIRT1抑制剂sirtinol、曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的影响,并探讨组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）在HBV复制过程中的作用。方法：运用MTS分析HepG2.2.15细胞对sirtinol、TSA的耐受程度;real-time PCR和Southern blot验证sirtinol和TSA对HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体表达的影响;Western blot和ELISA分析sirtinol对HBV核心蛋白（HBc）和HBsAg、HBeAg表达的影响。结果：sirtinol能抑制HBV复制中间体、HBc的表达和HBsAg、HBeAg的分泌,TSA可以促进HBV的复制。结论：SIRT1抑制剂sirtinol具有抗病毒作用。     

基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用

目的：用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因。方法：首先,将pU21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;最后,用5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被pU21质粒捕获的基因。结果：成功获得了约300株稳定转染pU21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株。通过5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被pU21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52（LINC00052）。结论：应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的。     

DHX15在HBV复制中的意义及其机制初步研究

目的：筛选DEx D/H-box家族中可能影响HBV增强子或核心启动子转录活性的基因,初步研究DHX15对HBV复制的调控作用。方法：克隆DEx D/H-box家族基因到表达质粒PCH9,并构建由HBV增强子和核心启动子驱动的海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc;分别将各种DDX表达质粒与pcore-Rluc共转染HepG2细胞,筛选影响Rluc荧光素酶活性的DDX家族成员。在HepG2细胞中共转染HBV1.3倍体质粒和DHX15表达质粒,通过Western blot检测DHX15在细胞中的表达,用 South－ern blot、Northern blot检测过表达DHX15对细胞中HBV复制水平和转录水平的影响。构建HBV增强子与核心启动子截短突变体,确定DHX15在HBV增强子或核心启动子上的作用区域。结果：成功构建30种DEx D/H-box家族基因克隆;筛选出对HBV增强子/核心启动子有明显影响的基因DHX15（P=0.042）;与对照组相比,过表达DHX15能促进HBV DNA的复制水平;并且能上调HBV RNA转录水平;成功构建HBV核心启动子截短突变体,发现DHX15促进HBV的复制是通过增强子实现的（t=8.292,P=0.001;t=5.215,P=0.006）。结论：过表达DHX15可通过影响HBV增强子的活性从而促进HBV复制。     

顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究

目的：探索顺铂诱导乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）再激活的机制。方法：将稳定表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38分为2组,即磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）对照组及顺铂（Cisplatin）处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1（cAMP responsive element binding protein 1,CREB1）、乙肝病毒蛋白表达（HBsAg、HBcAg）及病毒复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）;同样在成功构建稳定敲低CREB1（shCREB1）的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）及蛋白表达水平（HBsAg、HBcAg）。结果：稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049（P=0.010）;HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060（P=0.003）;HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047（P=0.005）。qRT-PCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400（P=0.006）;HBV mRNA相对表达量为3.084±0.256（P=0.000）;以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的Hep－AD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平。qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125（P=0.000）;HBV mRNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056（P=0.000）。Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036（P=0.021）、1.681±0.015（P=0.000）。结论：顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调。     

乙肝病毒核心蛋白序列特征的生物信息学分析北大核心CSCD

目的乙型肝炎病毒C基因编码的核心(HBc)蛋白抗原性强,也与持续性病毒感染有关。采用生物信息学方法分析HBc蛋白的结构和序列特征,有助于HBc蛋白的优化表达和纯化,并为乙肝患者的治疗以及疫苗的研制提供参考。方法乙肝病毒HBc序列的获取来源于NCBI网站GenBank数据库。运用Prot-Param和ProtScale工具在线预测乙肝病毒HBc的理化性质及其亲疏水性;通过在线软件SignalP 4.0Server和TMHMM分别分析该序列的信号肽特征,跨膜区域及磷酸化位点;利用SOPMA和SWISS-MODEL全自动在线软件预测其二级结构和三级结构模型;利用IEDB Analysis Resource,ABCpred和SYFPEITHI HLA-A;02:01预测该蛋白抗原表位,利用Venny2.1.0工具筛选该蛋白最佳表位形成位置等。结果HBc蛋白由212个氨基酸组成,分子式为C_(1086)H_(1710)N_(314)O_(300)S_(12),分子质量单位为24.35017ku,理论等电点为9.49。为不稳定亲水性蛋白质。该蛋白质具有信号肽,没有跨膜区域,具有40个潜在的磷酸化位点。预测其主要二级结构为α螺旋和无规卷曲,含量分别36.32%和41.04%。结合HBc蛋白序列的T、B细胞表面抗原、表面可及性、β转角、线性表位的预测结果,发现HBc蛋白具有T、B细胞抗原表位,并且存在4个潜在的优势抗原决定簇区域,分别为37-38、110、158-164、180-208位氨基酸。结论生物信息学方法预测HBc蛋白存在潜在的抗原表位区域,具有多个磷酸化位点。这有利于疫苗的研发与制备。     

基于结构方程模型的我国西部女性性工作者暴露前用药使用意愿的影响因素研究

目的应用结构方程模型(Structural Equation Model,SEM)对我国西部女性性工作者暴露前用药(pre-exposure prophylaxis,Pr-EP)使用意愿影响因素进行分析,为在我国西部高危人群中使用Pr-EP减少HIV新发感染提供可行性的信息依据。方法在中国西部的重庆、四川、广西、新疆四地对女性性工作者进行问卷调查,对调查数据运用探索性因子分析提取因子后,结合专业知识构建全结构方程模型并进行分析。结果 Pr-EP使用意愿较高,为54.93%(886/1 613)。社会支持对Pr-EP使用意愿起正向影响(效应系数为0.20),社会歧视对Pr-EP使用意愿起负向影响(效应系数为-0.18),AIDS知识对Pr-EP使用意愿的影响(效应系数为0.38)可分解为直接影响和通过安全套使用而影响的间接作用(相应的效应系数分别为0.37和0.01)。危险感知对Pr-EP使用意愿的总作用为0.53,危险感知对Pr-EP使用意愿影响既存在直接影响(效应系数为0.43),又通过影响安全套使用对其存在间接效应(效应系数为0.10)。结论运用SEM可较好地分析各影响因素之间的直接和(或)间接效应,开展Pr-EP,应进行广泛的宣传教育,降低高危行为,减少羞辱和歧视,有效地宣传来消除社会偏见。本研究为在我国西部高危人群中使用Pr-EP减少HIV新发感染提供可行性的信息依据。     

骨形态发生蛋白和白血病抑制因子诱导肝干细胞分化

目的 在永生化的小鼠肝干（祖）细胞(HP)模型上筛选并优化高效的肝细胞定向分化诱导方法,探讨HP向肝细胞定向分化过程及分子机制。 方法分别采用含人白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白(BMP)2和BMP9基因的重组腺病毒感染HP,在病毒感染后第4天、第7天和第10天用糖原染色和吲哚花青绿(ICG)摄取实验观察HP的分化成熟度,并在第4、7、10、14天通过检测白蛋白启动子调控的荧光素酶报告基因活性,观察细胞合成白蛋白情况。计量资料比较用t检验。结果 BMP2和BMP9对HP的诱导作用最强,荧光素酶活性、PAS染色和ICG摄取细胞阳性率随诱导时间的延长明显上升,在诱导后第7天最高,HP对BMP9的诱导应答最强,与对照组相比,酶活性增加了近9倍（t=17.30,P＜0.01）,BMP2处理组增加了5倍（t=16.41,P＜0.01）,LIF处理组增加了3倍（t=6.04,P＜0.01）。诱导第7天时,PAS染色细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为30％和45％; ICG细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为40％和30％。LIF诱导后,PAS染色、ICG摄取细胞阳性率以及荧光素酶活性有一定增加。结论 BMP2、BMP9和LIF能够诱导HP向发育晚期肝细胞分化,并初步具备成熟肝细胞的一些功能。