重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA的构建、鉴定及其对人脐静脉内皮细胞增生的影响

背景 脉络膜新生血管(CNV)是多种眼部疾病致盲的原因之一,研究发现补体系统在CNV的发病机制中起重要作用.目的 构建针对补体因子B(CFB)的小干扰RNA(siRNA)重组质粒,体外观察其对人脐静脉内皮细胞ECV-304增生的影响.方法 根据人CFB的基因序列设计引物,经PCR扩增后与质粒pRNAT-U6.1连接,得到重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA,并进行测序鉴定和PCR鉴定.ECV-304细胞株进行常规培养,用电转染技术将重组质粒或空质粒分别转染人ECV-304细胞株,分为CFB-siRNA转染组和空质粒转染组,未转染的细胞为空白对照组.细胞转染后继续培养48 h,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并计算转染效率;采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法测定各组细胞中CFB mRNA的相对表达量;用MTT法检测各组细胞转染24、48和72 h时细胞的增生值(A)并计算生长抑制率;利用流式细胞技术检测各组细胞的生长周期变化.结果 PCR扩增的目的片段序列与CFB基因序列完全相符,ECV-304细胞转染后,倒置荧光显微镜下可见CFB-siRNA转染组和空质粒转染组的细胞中GFP呈绿色荧光.半定量RT-PCR结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组的CFB mRNA相对表达量分别为0.07±0.04、0.14±0.02和0.14 ±0.03,总体比较差异有统计学意义(F=233.05,P=0.00);其中CFB-siRNA转染组CFB mRNA相对表达量明显低于空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).MTT法检测结果显示,各组不同时间细胞增生抑制率总体比较差异有统计学意义(F分组=212.99,P=0.00);CFB-siRNA转染组细胞转染24、48、72 h后细胞增生的抑制率分别为(23.45±0.01)％、(33.48±0.02)％和(45.49±0.01)％,明显高于同时间点空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组G1期的细胞数占总细胞数的(44.4±0.5)％、(25.8±0.4)％和(27.9±0.6)％,总体比较差异有统计学意义(F=58.98,P=0.00);CFB-siRNA转染组G1期和G2期细胞所占百分比显著高于空白对照组和空质粒转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA可通过将细胞阻滞在G1期而有效抑制人脐静脉内皮细胞的增生.     

小干扰RNA沉默 HIF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2 表达的影响

目的：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤(human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。

方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组; 对正常组细胞用含有浓度为10%的胎牛血清和1%的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/L CoCl₂以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达,行Western-blot检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。

结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.05),证实转染成功; 干扰组HIF-1αmRNA和MMP-2 mRNA和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

糖尿病大鼠玻璃体腔注射缺氧诱导因子-1α siRNA对血管内皮生长因子蛋白表达的影响

目的：观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)小干扰RNA(siRNA)对糖尿病大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达的抑制作用,及其用于糖尿病新生血管性疾病治疗的可行性。

方法：以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建HIF-1α.siRNA 重组质粒。选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只,随机分为正常对照组(15只)和实验组(39只)。实验组采用尾静脉注射链尿佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,造模成功后将实验组随机分为糖尿病组(15只)、基因治疗组(12只)和空载体组(12只)。正常对照组及糖尿病组大鼠均不做转染; 基因治疗组和空载体组分别转染HIF-1α.siRNA 重组质粒和pSilencer空载体质粒。行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察视网膜组织形态,并采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。分别于干扰后24、48、72h,1wk时计算VEGF蛋白的抑制效率。采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。

结果：HIF-1α.siRNA 重组质粒经酶切、测序鉴定,确定为目的序列。HE染色显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜不完整,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示：VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,主要位于神经节细胞层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF蛋白抑制率24、48、72h和1wk时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。

结论：HIF-1α.siRNA重组质粒能够抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白的表达,可能成为一种治疗糖尿病性新生血管疾病的新方法。     

盐酸左布比卡因及其注射剂细菌内毒素检查方法的建立

目的:建立盐酸左布比卡因及其注射剂细菌内毒素的检查方法。方法:按2010年版《中国药典》(二部)附录细菌内毒素检查法的要求,通过干扰试验确定样品最大不干扰质量浓度,并进行方法学验证。结果:样品的质量浓度为1.56 mg/ml(λ=0.25EU/ml)时对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应无干扰;样品的细菌内毒素限值确定为0.08 EU/mg。结论:所建立的方法可用于盐酸左布比卡因及其注射剂的细菌内毒素检查。     

抑制IGF2基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用

目的:研究抑制人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用。方法:将重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控抑制IGF2基因的siRNA表达载体pGL3-h AFP-hTERT-siRNA3(简称siRNA3)转染Huh-7细胞和正常肝L-02细胞,另设阴性对照(载体p GL3-hAFP-hTERT)组和空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞转染48 h后IGF2 mRNA表达;酶标仪检测转染0、24、48、72 h后的细胞活性;流式细胞仪检测转染48h后细胞周期、细胞凋亡;Western blot法检测细胞IGF2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)E2、Cyclin D2、Cdc2、Bcl-2蛋白表达水平。结果:与阴性对照组和空白对照组比较,转染siRNA3的Huh-7细胞中IGF2 mRNA表达明显减弱,转染48、72 h后Huh-7细胞活性明显降低,G1期Huh-7细胞明显增加,S期Huh-7细胞明显减少;Huh-7细胞早期、晚期及总凋亡百分比均明显增加,IGF2、PCNA、Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2和Bcl-2蛋白表达均明显减弱,以上差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。转染siRNA3表达载体的L-02细胞上述指标均无明显变化(P>0.05)。结论:重组hAFP和hTERT双启动子调控针对IGF2基因的siRNA可特异性抑制Huh-7细胞IGF2表达及细胞增殖,其可能与下调IGF2 mRNA及蛋白表达,进而引起细胞增殖相关基因PCNA、细胞周期调控相关基因Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2及细胞凋亡调控相关基因Bcl-2蛋白表达下调有关。     

长春西汀原料药细菌内毒素检查法研究

目的:建立长春西汀原料药细菌内毒素检查方法。方法:按2010年版《中国药典》(二部)附录ⅪE细菌内毒素检查法,采用两个厂家的鲎试剂(TAL),对不同批号的样品进行了干扰试验和细菌内毒素检查。结果:高质量浓度长春西汀溶液对TAL与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用,经稀释后可排除干扰。结论:本品不干扰质量浓度为0.25 mg/ml,可采用细菌内毒素检查法进行质量控制。     

ALEX1在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究ALEX1基因在宫颈癌组织与癌旁组织中的表达情况,探讨ALEX1基因对宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法应用免疫组化检测临床宫颈癌组织与癌旁组织中ALEX1的表达情况,通过小干扰RNA技术沉默ALEX1,并通过流式细胞仪检测沉默ALEX1后He La细胞的周期、凋亡变化情况,利用CCK-8检测其增殖情况及对抗癌药物白藜芦醇敏感性的影响。结果免疫组化结果显示,临床宫颈癌组织中ALEX1高表达。与对照组He La细胞相比,沉默ALEX1实验组细胞生长受到明显抑制,并且增强白藜芦醇对其的抑制作用,细胞周期阻滞在S期。结论沉默ALEX1能有效阻滞He La细胞的生长能力及增强白藜芦醇对He La细胞的抑制作用。     

金属冠脉支架磁共振适用性检测方法

目的:建立金属冠脉支架磁共振适用性实验平台,以实验室测试为基础,研究金属冠脉支架的磁共振适用性。方法:金属冠脉支架磁共振适用性试验分为四个部分,在3T磁共振环境下,分别进行磁位移力试验、磁扭矩试验、致热试验和图像干扰试验。结果:退磁效果好的金属冠脉支架,磁位移力小于其自身重力,磁扭矩小于其自身重力扭矩,温度升高值小,图像畸变值小。退磁效果不好的支架,磁位移力大于其自身重力,温度升高多,图像畸变值大。结论:实验平台可以对金属冠脉支架磁共振适用性进行检测,并对其退磁效果进行评价。     

小干扰RNA非病毒递送载体的研究进展

虽然RNA干扰应用在哺乳动物细胞中的时间较短,但siRNA强效抑制靶基因表达的功能使它成为目前广泛研究的一种药物。siRNA作为新型的基因药物可有效治疗多种恶性疾病,比如癌症、病毒性感染疾病、遗传及代谢紊乱性疾病等。siRNA在体内不稳定,易被核酸酶降解,有触发免疫反应的倾向,因此选择安全稳定的载体将其递送到靶组织靶细胞是siRNA在体内发挥作用的前提。非病毒载体低毒、低免疫反应且结构可控,目前已被广泛使用来解决基因递送过程中遇到的困难。文章主要综述了近年来研究广泛的siRNA非病毒递送载体:脂质体、阳离子聚合物、树枝状大分子、无机纳米材料等。     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。