低剂量三氯乙烯诱导人正常肝细胞损伤耐受差异表达基因的研究

目的寻找低剂量三氯乙烯(TCE)诱导人正常肝细胞(L02)损伤耐受差异表达的基因。方法参照本实验室用MTT法所得的TCE对L02毒性剂量-效应关系,选择5μmolL的三氯乙烯为低剂量,40μmolL为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量刺激24小时,再用高剂量刺激6小时),然后用荧光差异显示PCR(FluoroDDPCR)寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定。结果按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到51个差异条带。对其中的11个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中9个已知基因,2个新基因。结论用荧光差异显示PCR方法寻找TCE诱导L02损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究TCE诱导L02的损伤耐受的机理提供科学依据。     

中国某水域海水养殖鱼和淡水养殖鱼中二噁英污染特征的比较研究

目的对中国某水域的海鱼和淡水鱼样品开展二英污染水平与同系物轮廓表征研究,并评估该典型地区人群通过鱼类暴露二英的膳食摄入量。方法通过布点抽样采集8个养殖点(海水与淡水各半)31份样品,以同位素稀释的HRGCHRMS-多离子检测方式测定样品中的PCDDsFs。结果海水养殖鱼和淡水养殖鱼中PCDDFs平均浓度以湿重计分别为1.43和3.34pgg,以WHOTEQ计分别为0.28pgg和0.43pgg。OCDD、2,3,7,8TCDF为最主要的优势污染同系物;如以毒性的主要贡献者计,则以1,2,3,7,8PeCDD、2,3,4,7,8PeCDF、2,3,7,8TCDD为主。该地区人群摄入鱼的二英PCDDFs的平均膳食暴露量的估算是0.63pgWHOTEQkgbw·day。结论该水域中的鱼已受到了一定程度的PCDDFs污染,淡水养殖鱼高于海水养殖鱼(约为1倍)。鱼体中所检测到的二英污染的平均水平低于欧盟制定的限量标准(3.0pgWHOTEQg)。     

三氯乙烯诱发SD大鼠产生免疫反应的模型研究

目的研究SD大鼠对三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)免疫刺激的反应,拟建立大鼠对TCE免疫反应的模型.方法背部皮内注射体积分数为15%的TCE免疫SD大鼠,1周1次,免疫5次后于大鼠左后足跖膜下注射TCE攻击,6h称左右后足重量计算肿胀度.取TCE免疫大鼠心脏血,分离并培养单个核细胞.将培养的细胞与系列浓度的TCE共同培养2d后,检测细胞酸性磷酸酶的活性,据此判断细胞的活化增殖程度.结果 TCE免疫大鼠攻击足肿胀度与空白对照组大鼠的相比差异显著(P＜0.005).体积分数为3%的TCE可使培养的大鼠血单个核细胞的增殖达到峰值.结论重复皮内注射TCE可使SD大鼠产生某种免疫反应.SD大鼠的单个核细胞可被TCE刺激活化.     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建

目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIRENRetroQ载体连接。用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFPC1载体重组构建pEGFPC1shRNA载体。结果重组构建的pEGFPC1P1、pEGFPC1P2、pEGFPC1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点。结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础。     

用Taqman MGB探针研究中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性

【目的】了解中国人群肿瘤坏死因子α（the tumour necrosis factor α，TNF-α）基因启动子区多态性。【方法】 随机选取20名深圳地区汉族健康体检者，采用两对引物PCR扩增TNF-α基因启动子区（-1389nt～＋125nt），对PCR产物进行序列分析，寻找单核苷酸多态性位点（single nueleofide polymorphisms，SNPs）。采用Taqman MGB探针建立了-857nt（C／T）位点的实时定量PCR（thereal-time PCR）分型方法，并对中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体共l108份样本进行了基因分型。【结果】在启动子区（-1322nt～＋67at），发现6个SNP位点，即-885（A／G）、-863（C／A）、-646（G／A）、-648（G/A）、-568（G／C）和-857（C/T），其中位点-646nt（G→A）为新发现SNP。-885、-648及-568nt位点碱基虽然与Genbank不同，但测序的20个个体基因分型相同。中国人群-857nt（C／T）位点基因型频率分别为0．79（CC），0．19（CT）和0．02（TT），中国汉族、壮族、布依族，水族及苗族群体间无显著性差异。中国人群-857T等位基因频率为0．116，与文献报道的韩国人群相同，但比日本人群低。【结论】中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性可能较保守。采用Taqman MGB探针实时定量PCR技术对SNPs进行基因分型简便、快速及准确，易于自动化，为大规模的疾病相关性研究提供了有效的工具。     

慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清sTREM-1水平及其临床诊断价值研究

目的 探讨慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）患者的血清可溶性髓细胞触发受体-1（souble triggering receptor expressed on myeloid cells-1,sTREM-1）水平及其诊断AECOPD的临床价值。方法 纳入2012年2月~2015年10月就诊的AECOPD患者70例,同时纳入稳定COPD患者44例（稳定COPD组）及健康人33例（健康对照组）作为对照。首次就诊时记录患者一般情况并检测呼吸功能,同时检测外周血sTREM-1水平、C反应蛋白（c-reactive protein,CRP）及降钙素原（procalcitonin,PCT）水平。结果 AECOPD组sTREM-1水平显著高于sCOPD组及健康对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。AECOPD组患者治疗前sTREM-1水平显著高于治疗后,差异有统计学意义（P<0.05）。AECOPD组患者血清sTREM-1与CRP（r=0.674,P=0.000）、PCT（r=0.616,P=0.000）、WBC（r=0.648,P=0.000）及呼吸功能GOLD分级（r=0.454,P=0.000）呈显著正相关;sTREM-1水平与PO₂（r=-0.363,P=0.002）、FEV1%（r=-0.489,P=0.000）呈显著负相关。血清sTREM-1单独诊断AECOPD的AUC为0.793（95% CI：0.717~0.868）,sTREM-1联合CRP及PCT诊断AECOPD的AUC为0.830（95% CI：0.762~0.898）。结论 AECOPD患者血清Strem-1水平可出现显著增高,且与呼吸功能损害严重程度相关。STREM-1可作为AECOPD诊断的候选指标,且联合CRP及PCT可进一步改进诊断效能。     

细胞复制衰老过程中IGF2R基因表达及H3组蛋白修饰的变化

目的 研究细胞复制性衰老过程中胰岛素样生长因子2受体基因（IGF2R）的表达与H3组蛋白修饰谱的变化。 方法 培养人胚肺成纤维细胞（HPF）,以细胞群倍增数(PDL)为23(PDL23)为年轻组细胞,PDL=50(PDL50)为复制衰老细胞,观察细胞复制衰老过程中生物学性状改变;采用实时定量PCR法观察细胞PDL30、PDL40、PDL50 IGF2R基因的表达, 并采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法（chromatinimmunoprecipitation-real time quantitative PCR methods,CHIP-PCR）检测IGF2R基因转录起始区组蛋白修饰(H3-Ac、H3K9-tri-Me、H3K9-Ac和H3K4-tri-Me) 的状况。 结果 与年轻细胞相比,衰老细胞体积变大,增殖能力减弱,细胞周期停滞,衰老特异性β-半乳糖苷酶着色阳性,IGF2R mRNA表达增加（P<0.05）,IGF2R mRNA表达与细胞PDL呈正相关(r=0.871)。相对年轻细胞而言,老年细胞的IGF2R基因在转录起始点上游0.6 kb处和转录起始点下游1.2 kb处以H3-Ac、H3K9-Ac和H3K4-tri-Me组蛋白修饰为主,而在转录起始点下游1.6~4.0 kb处H3K9-Ac修饰降低,H3K9-tri-Me组蛋白修饰升高,但H3K4-tri-Me组蛋白修饰占主要地位。 结论 IGF2R与细胞衰老程度相关,其基因表达受H3组蛋白修饰调控,表观遗传学参与细胞衰老进程。     

聚ADP核糖聚合酶1与DNA甲基化的关系及其可能的机制

聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶,主要存在于细胞核内,少量存在于细胞浆内[1],具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用.尽管目前PARP家族至少有18名成员,但研究表明,PARP-1活力占所有PARP蛋白活力的90％以上.PARP-1在绝大多数组织中为组成型表达,但受到DNA链断裂等损伤激活后,其活力会立即上升500倍以上[2-3].PARP-1是该家族中最重要的一员,具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能[4-6],在维持基因组稳定和细胞死亡及调控基因组的甲基化模式的过程中发挥着重要作用[7-9].     

PARP-1基因Val762Ala多态性与乳腺癌易感性的关系

目的探讨DNA修复基因聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单核苷酸多态性位点Val762Ala基因多态性与中国人群乳腺癌易感性的关系。方法采用Sequenom MassARRAY单核苷酸多态性(SNP)基因型分析技术对经病理确诊的原发性乳腺癌女性患者837例(病例组)和健康对照组865例进行PARP-1基因单核苷酸位点Val762Ala基因分型。以非条件logistic回归计算优势比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(CI)评价各基因型与乳腺癌发病风险的关系。数据均由SPSS13.0统计软件分析。结果病例组和对照组中TT、TC、CC和TC+CC 4种基因型的分布分别差异无统计学意义,OR[95%CI]值分别为1、1.07(0.83～1.39)、1.03(0.70～1.36)、1.08(0.82～1.33)。结论 Val762Ala基因型与乳腺癌易感性无显著相关性。PARP-1基因Val762Ala多态性在乳腺癌发病过程中无作用。