小鼠热休克蛋白10(HSP10)基因腺病毒载体的构建及在卵泡中的表达

目的:构建小鼠热休克蛋白(heat shock protein 10,HSP10)基因重组腺病毒载体,为更好地研究HSP10蛋白在PCOS发病中的作用。方法:用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增HSP10基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至AdEasy腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-HSP10。PmeI酶切pAdtrack-HSP10,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-HSP10转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-HSP10后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。用获得的重组腺病毒感染小鼠卵泡,Western blotting方法检测HSP10基因的表达。结果:从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的cDNA,PCR和测序分析证实为小鼠HSP10基因。构建的小鼠HSP10基因的重组腺病毒载体,PacI酶切重组质粒见30000bp和4500bp的特征性条带。制备出高滴度重组腺病毒,病毒上清PCR反应同样扩出309bp的目的条带。分离并培养小鼠卵泡,感染重组的腺病毒,Western blotting检测到显著的HSP10条带。结论:本文成功构建了小鼠HSP10基因重组腺病毒载体,并且在小鼠卵泡中有效表达。     

血清钙磷水平与体外受精和卵胞浆内单精子注射结局的相关性初步观察

钙离子震荡是卵激活的重要因素,一些因素通过诱发卵内的钙离子震荡,从而完成受精过程并控制早期胚胎发育.血液中生物活性的钙浓度随着月经周期呈现周期性变化[1],而血清中钙和磷水平密切相关,研究发现排卵前卵泡液中的钙离子浓度与血清中高度接近[2,3].血清钙/磷水平与体外受精和卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)妊娠结局之间的关系研究较少,本文主要通过回顾性病例研究分析血清钙磷水平与IVF/ICSI妊娠结局的相关性.     

单细胞微阵列比较基因组杂交技术在胚胎植入前遗传学筛查中的应用

目的 建立利用单细胞微阵列比较基因组杂交(array CGH,aCGH)技术进行胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术平台,并应用aCGH技术进行PGS获得持续妊娠. 方法 采集废弃胚胎来源卵裂球10个,核型正常男性(46,XY)淋巴细胞3个,通过单细胞全基因组扩增后,利用aCGH技术进行染色体非整倍体分析;在此基础上,将aCGH技术应用于临床一例反复流产患者. 结果 3个淋巴细胞及9个废胚来源卵裂球的全基因组扩增成功,1个废胚来源卵裂球扩增失败,扩增成功的样本通过aCGH检测后均获得明确的诊断,3个淋巴细胞分析结果与已知核型一致;临床病例5个胚胎活检的单卵裂球均得到明确诊断,移植1枚正常整倍体胚胎后获得临床持续妊娠. 结论 在胚胎植入前遗传学筛查中,单细胞aCGH技术能全面地评估胚胎染色体组情况,可应用于临床PGS.     

现代遗传学/基因组学在生殖医学领域的应用展望

改善生殖健康和降低出生缺陷问题,是我们21世纪生殖医学领域的重要使命。根据中华人民共和国卫生和计划生育委员会2012年9月发布的中国出生缺陷防治报告,我国2011年出生缺陷的发生率为5.6%,每年新增病例90万,发病率较发达国家高近2倍,每年国家和社会的经济负担高达数千亿元。出生缺陷和生殖相关疾病,包括不孕症,大多属于复杂性疾病,由遗传和环境的相互作用导致。2003年第一个人类基因组计划的完成,敲开了后基因组时代和基因组医学的大门,为个体化医学奠定了基础。在过去的十年里,现代高通量基因检测技术,例如生物芯片和新一代测序技术,迅速地进入生殖医学领域,发现了大量与出生缺陷和生殖障碍疾病相关的遗传学和基因组变异,体现了生命科学、生物医学、信息学、计算数学的交叉和融合的强大生命力。这篇述评重点介绍了现代遗传学/基因组学技术在中国生殖医学领域的研究和应用成果,包括在《Cell》和《Nature》杂志上分别发表的用高通量基因组检测技术对人类卵母细胞和胚胎发育相关的研究;在《Nature Genetics》杂志发表的2篇关于多囊卵巢综合征（PCOS）8226例患者和7578例对照的全基因组关联分析（GWAS）研究;在《New England Journal of Medicine》杂志发表的2篇采用全外显子测序技术进行的关于卵巢早衰/原发性卵巢功能不全（POF/POI）的研究;在《Nature Genetics》杂志发表的中国汉族男性2927例非梗阻性无精子症和5734例对照的GWAS研究。还简要介绍了关于应用高通量基因组学技术在子宫内膜异位症和胚胎植入前遗传学诊断/筛查的研究进展。这些现代技术的应用,将会大大促进和提高临床生殖医学的进步,改善妊娠结局。     

供精人工授精临床结局影响因素分析

目的：探讨供精人工授精（AID）临床结局的影响因素。方法：回顾性分析2012年1月—2017年4月1 810对夫妇共4 067个AID周期的临床资料,分析女方年龄、女方不孕因素、治疗方案、授精时机及治疗周期数与临床结局的相关性。结果：①临床妊娠率、活产率随年龄增长均有下降趋势（均P＜0.05）。②女方合并排卵障碍、盆腔子宫内膜异位症术后及盆腔炎性疾病后遗症者AID临床结局与单纯男方因素者相比,差异均无统计学意义（均P＞0.05）。③自然周期、氯米芬、来曲唑及单纯促性腺激素（Gn）促排卵周期的临床妊娠率、宫内妊娠流产率和活产率差异均无统计学意义（均P＞0.05）;氯米芬和来曲唑促排卵周期的多胎妊娠率显著高于自然周期（均P＜0.001）。④无论自然周期还是促排卵周期,排卵前与排卵后授精的临床结局比较,差异均无统计学意义（均P＞0.05）。⑤前4个治疗周期随着治疗周期数的增加,累计妊娠率与累计活产率显著升高（均P＜0.05),第5个治疗周期开始累计妊娠率与累计活产率均无明显增长（均P＞0.05）。结论：女性年龄是影响AID临床结局的重要因素;未发现其他女性不孕因素及授精时机显著影响AID临床结局。实施3个或4个AID周期仍未孕者或女性年龄超过40岁建议行供精体外受精助孕。     

体外受精-胚胎移植前检测宫颈分泌物支原体及衣原体意义的探讨

目的:分析体外授精/单精子卵胞浆内显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)前解脲支原体(UU)和沙眼衣原体(CT)感染与妊娠结局的关系.探讨IVF/ICSI-ET前常规检测宫颈分泌物UU和CT的临床意义.方法:回顾性分析2008年1-12 月首次在该中心行IVF/ICSI-ET,术前进行宫颈分泌物UU 和CT 检测的患者共1 802 例,根据UU 和CT 检测结果,将患者分为UU 和CT均阴性、UU 阳性、CT 阳性3 组,比较各组间受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、种植率、异位妊娠发生率和流产率有无差异以及CT或UU 感染与不孕类型、是否存在盆腔因素病因、阴道清洁度、对移植操作的影响等关系.结果:不孕患者IVF/ICSI-ET治疗时UU感染患者的妊娠结局未受到影响,CT 感染对妊娠结局有负面影响.结论:对于无症状的UU 感染患者IVF术前不必要投入大量抗生素治疗,对于CT感染者建议治愈后进行胚胎移植.     

一个X连锁少汗型外胚层发育不良家系的EDA基因c.822G＞T突变分析

目的 对1个少汗型外胚层发育不良家系进行ectodysplasin A(EDA)基因序列分析,为家系成员提供准确病因诊断和遗传咨询.方法 抽取家系中先证者及有血缘关系的家系成员外周静脉血,常规提取基因组DNA,应用聚合酶链式反应、DNA测序技术分析EDA基因编码区序列;选择103名无血缘关系正常人作为对照.结果 在先证者及另1例男性患者的EDA基因第7外显子区域检出c.822G＞T突变,导致第274位的色氨酸变成了半胱氨酸(p.W274C),该突变位点未见文献报道.家系中的5名女性成员中检出c.822G＞T杂合突变,正常男性成员及103名正常对照均不存在此突变.结论 EDA基因c.822 G＞T突变为导致该家系成员少汗型外胚层发育不良的致病突变.     

小鼠卵巢蛋白质双向凝胶电泳蛋白谱系的初步建立及其功能分析

目的:初步建立性成熟小鼠卵巢蛋白质图谱,并对其中的蛋白质功能进行研究.方法:通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组,并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究.结果:(1)获得高重复性和高分辨率小鼠卵巢蛋白图谱.软件分析显示,3个不同卵巢样品24 cm银染蛋白凝胶上的蛋白点均有±2 000点,胶重复性好,大部分蛋白点位于相对相同的位置.(2)质谱共鉴定出52种蛋白质,按功能对其进行分类:参与细胞代谢、细胞信号传导/交流、细胞结构/运动、细胞/器官防御与抗氧化作用、调节RNA合成、调节蛋白表达及未分类.(3)通过对其中的一种蛋白(GRP78)行免疫组化分析,发现随着卵巢由卵泡早期逐渐生长到排卵前卵泡期成熟并转向黄体期,其在颗粒细胞中的表达信号增强.结论:(1)3个不同卵巢样品蛋白质双向电泳图重复性好.我们通过质谱分析共鉴定出约52种蛋白质,初步构建了小鼠卵巢双向电泳蛋白图谱,对研究卵巢病理与生理、发育过程有着重要的参考价值.(2)行免疫组化分析结果显示,在卵巢周期变化过程中,GRP78蛋白对颗粒细胞的增生、分化、形成黄体颗粒细胞起着重要的调控作用.     

利维爱对绝经后妇女骨密度及骨代谢指标的影响

目的了解利维爱对绝经后妇女骨密度及骨代谢指标的影响 . 方法将 123例自然绝经后妇女随机分 2组 研究组每日口服利维爱 1.25 mg+ 钙尔奇 D 600 mg, 对照组每日口服钙尔奇 D 600 mg, 观察 12个月 . 用药前后分别检测腰椎 (L 2～ 4)及股骨颈 (NK)骨密度 (BMD)骨代谢指标血清骨钙素 (BGP)和碱性磷酸酶 (AKP)及尿吡啶酚 /肌酐 (Pyr/cr)和钙 /肌酐 (Ca/Cr)比值 . 结果 (1)L 2～ 4、 NK两部位 BMD 研究组治疗后均增加 , 且前者上升有显著性差异 (P< 0.05);对照组均下降无显著性差异 (P >0.05);治疗后 2组间比较有显著性差异 (P< 0.01,P< 0.05). (2)生化指标血 BGP、 AKP及尿 Pyr/Cr、 Ca/Cr 治疗后研究组均上升有显著性差异 (P< 0.01,P< 0.05); 对照组变化无显著性差异 (P >0.05). 结论绝经后妇女每日服用 1.25 mg利维爱加钙尔奇 D可以提高骨量 ; 单用钙尔奇 D不能防止骨丢失 .     

雄激素对颗粒细胞乳酸生成的抑制作用

目的：观察雄激素对卵巢颗粒细胞乳酸生成的抑制作用,探讨多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）高雄激素状态下的颗粒细胞乳酸生成及其对卵泡发育的影响。方法：体外培养人卵巢癌颗粒细胞系KGN细胞,用不同浓度睾酮（0.1~1 000 nmol/L）处理不同时间（0~48 h）。测定培养上清液中乳酸含量,采用实时聚合酶链反应（real?time PCR）以及蛋白质印迹法（Western blot）分别检测细胞内乳酸脱氢酶A（LDHA）和乳酸脱氢酶B（LDHB）的mRNA及蛋白质表达水平。结果：人卵巢颗粒细胞系KGN细胞经1 000、100、1 nmol/L睾酮处理24 h或者1、10 nmol/L睾酮处理24及36 h后,其乳酸生成量显著减少（P < 0.05）。并且,在100、1 nmol/L睾酮处理24 h后,KGN细胞内LDHA、LDHB的mRNA及蛋白质表达水平显著降低（P < 0.05）。结论：较高浓度雄激素通过抑制卵巢颗粒细胞内LDHA、LDHB的表达从而降低乳酸生成,可能与PCOS卵泡发育障碍相关。