肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳方法的建立和优化

目的建立和优化肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术,获取高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。方法提取肺癌组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向,在上述过程中分别对蛋白提取、等电聚焦电泳和凝胶染色进行控制和优化,利用ImageMaster 2Dplatinum 6.0分析软件获得二维凝胶图像。结果实验重复3次,共获15幅二维凝胶图像,平均蛋白质点数为1 137±57;随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅图像中蛋白点进行匹配,匹配率为90.4%。结论优化肺癌组织蛋白质组2-DE技术可获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱,为开展肺癌组织蛋白质组学研究打下基础。     

人骨肉瘤蛋白质组双向凝胶电泳图像分析方法的建立与应用

目的： 建立人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。方法： 组织标本分为骨肉瘤组和肿瘤旁组。对第一向双向电泳的关键因素与环节进行一系列优化。分离骨肉瘤总蛋白，银染，用ImageMasLer 2D Elite 3.01分析软件分析图谱，使用基质辅助电离解析飞行时间质谱仪主要高丰度部分差异蛋白质进行鉴定。结果：获得分辨率和重复性好的双向电泳图谱。变异系数平均值（%）和变异系数范围（%）：骨肉瘤组为23.00±10.11和3.80～6.89，肿瘤旁组为20.33±9.90和2.70～6.89。同一蛋白质斑点在3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为（8.93±1.17）%、（10.16±2.02）%和（10.87±3.86）%。初步鉴定11个蛋白，其中9个蛋白质只在骨肉瘤中特异高峰度上调表达，分别为转甲状腺素蛋白、磷酸甘油醛异构酶、慢收缩骨骼肌钙蛋白T、心肌钙蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、膜联蛋白-5、 热休克蛋白-1及Fanconi anemia groupD2蛋白；鉴定2个蛋白，锰超氧化物歧化酶、碳酸酐酶蛋白质下调表达。结论：成功构建了用于研究骨肉瘤蛋白质组双向凝胶图谱分析方法，认为初步鉴定的部分差异蛋白可能为骨肉瘤的关联蛋白，其在骨肉瘤发生和进展的病理过程中具有重要作用。     

脑脊液双向凝胶电泳体系的建立

利用比较蛋白质组学技术可鉴定不同状态下各种脑脊液样本之间蛋白质表达的差异,有助于了解疾病的病理生理过程、寻找新的药物靶点。而双向电泳技术(two d im ensionalelectrophoresis 2-DE)是蛋白质组技术的基础,本研究目的是建立脑脊液双向凝胶电泳体系。1材料和方法1.1试剂Am     

结肠癌组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析结肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离结肠癌病人配对癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织的总蛋白,银染显色,PDQuest 2DE软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱.图像分析显示,3组胶的平均匹配率分别为:癌组织87.3%、癌旁组织80.3%、正常结肠黏膜组织84.0%.等电聚焦方向上的平均偏差为(1.16±0.29)mm,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方向上的平均偏差为(1.00±0.38)mm.差异分析共获得164个差异表达的蛋白质点.结论 双向凝胶电泳分离结肠癌组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找结肠癌早期诊断的分子标记物提供了理论依据.     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的：建立血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术。方法：对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化。结果：建立了稳定的2-DE技术。结论：已建立的血清蛋白质2-DE技术，将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的建立血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术.方法对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化.结果建立了稳定的2-DE技术.结论已建立的血清蛋白质2-DE技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.     

日本血吸虫虫卵蛋白组双向凝胶电泳的初步探讨

目的:寻找日本血吸虫虫卵蛋白质抗原组分分析的一条新途径。方法:以日本血吸虫虫卵为材料,用固相pH梯度等电聚焦和SDS-PAGE双向凝胶电泳方法对其进行蛋白组分析。结果:获得日本血吸虫虫卵蛋白组双向凝胶电泳图谱。结论:双向凝胶电泳蛋白组分析方法可运用于日本血吸虫虫卵蛋白组的分析。     

多囊卵巢综合征患者血清蛋白质双向凝胶电泳技术条件优化

目的探讨多囊卵巢综合征（PCOS）患者外周静脉血血清蛋白质的双向凝胶电泳条件优化。方法对去除血清中的高丰度蛋白与否、不同蛋白质上样量、固相pH梯度（IPG）胶条的pH值范围、水化上样液体积、水化时间进行双向电泳实验结果比较。结果将去除高丰度蛋白血清样品中300μg蛋白质溶解于终体积为400μl水化上样液,水化14h,应用pH4～7的IPG胶条和浓度12％的SDS—PAGE凝胶进行双向电泳,得到图象清晰,蛋白斑点数为369个蛋白质二维图谱。结论优化了PCOS血清双向凝胶电泳的条件,得到分辨率较好的PCOS血清的蛋白图谱,创造了进一步开展PCOS血清蛋白质组图谱分析条件。     

人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术研究

目的 :利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术 (2 DE)建立正常精子的蛋白质图谱。方法 :比较不同蛋白质提取方法和上样量、不同的第一向等点聚焦方法所得图谱的差别 ,并初步建立人类正常精子的蛋白质图谱。结果 :用蛋白质提取方法一制得的样本电泳后有 6 70～ 70 3个蛋白质斑点 ;方法二所得样本电泳后仅有 194～ 2 10个蛋白质斑点。蛋白质提取方法一所制样本进行载体两性电解质pH梯度 SDS电泳技术 (ISO DALT)得到约 2 80～ 30 0个蛋白质斑点 ,用固相pH梯度 SDS电泳技术 (IPG DALT)得到多达 70 0个蛋白质斑点。结论 :采用蛋白质提取方法一制备精子蛋白质进行IPG DALT电泳的方法适用于建立精子全细胞蛋白质谱。     

人结肠腺癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化

目的优化人结肠癌Lovo细胞系的蛋白质样品制备方法,建立人结肠癌Lovo细胞系的双向凝胶电泳(2-DE)图谱.方法分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞,胰酶酶解后裂解和皿上直接裂解的方法提取所培养Lovo细胞的总蛋白质,利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析2-DE图谱.结果以等渗蔗糖缓冲液冲洗细胞并经皿上直接裂解的方法所提取Lovo细胞总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌Lovo细胞系2-DE图谱.结论以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

肾癌及癌旁组织蛋白质组学的比较研究

目的：建立肾癌及癌旁组织比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系。方法：取病理证实的肾癌及癌旁组织,研磨、超声裂解、抽提蛋白,采用双向凝胶电泳分离,进行染色,Image Master 2D Platinum软件分析、识别差异表达蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果：从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点：肾癌组织(1326±78)个,癌旁组织(1232±56)个。显著差异蛋白质点46个,对其中7个点进行了筛选鉴定。结论：分析这些差异蛋白有助于寻找具有普遍性意义的肾癌标志物,进而为肾癌的早期诊断和防治提供理论和实验依据。     

多发性硬化患者脑脊液蛋白质组学的研究

目的：筛选并鉴定多发性硬化患者脑脊液特异蛋白，探讨多发性硬化的发病机制。方法：以实验室确诊型和临床怀疑型多发性硬化患者的脑脊液为研究对象，采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离总蛋白质,凝胶经银染色后,Image Master 2D Platinum 5.0图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果：从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点,共鉴定出35种蛋白，并且发现其中大多是在正常的脑脊液中存在的，其中有6种是在多发性硬化双向凝胶谱库中已有的,有4种是本实验所发现的。结论：本研究识别并鉴定了4种多发性硬化患者脑脊液特异蛋白，但这4种蛋白质与多发性硬化的关系有待进一步研究。     

细胞裂解液对蛋白质定量方法的影响

目的:观察不同细胞裂解液对Bradford法和bicinchoninic acid(BCA)法的影响,以确定适合蛋白质组学研究中细胞全蛋白含量的定量方法。方法:采用Bradford法和BCA法测定牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)样品溶液,样品BSA溶液分别由双蒸水和不同裂解液(荧光差异双向凝胶电泳裂解液、三种传统双向凝胶电泳裂解液)配制;然后,采用这两种方法测定上述裂解液所提取的细胞全蛋白样品;采用Bradford法定量反复冻融、不同比色杯和不同时期标准曲线下的样品。结果:各细胞裂解液对Bradford法均有显著性影响,使所定量的BSA浓度普遍偏高1.2至2倍,但定量值可随着加样浓度的增加而增加(r=0.989~0.996,P<0.05);各裂解液对BCA法也均有显著性的干扰,多数定量结果超出仪器读数范围;对于同批全蛋白溶液样品,BCA法的定量结果与Bradford法相比可有千倍差异;反复冻融后蛋白浓度变化统计学上无显著性差异,但有下降趋势,不同比色杯和不同时期标准曲线对Bradford法无显著影响。结论:Bradford法是蛋白质组学中细胞全蛋白定量的较适方法,但需根据具体实验进行优化。     

脑脊液双向电泳技术体系的建立

目的:建立用于脑脊液(CSF)蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找多发性硬化患者和对照组脑脊液蛋白质差异,从分子水平探讨多发性硬化患者脑脊液蛋白整体变化规律。方法:分别取对照组及多发性硬化患者的脑脊液,用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质后,加入适量裂解液使蛋白质充分裂解,离心后取上清液上样。进行第1向等电聚焦(IEF)电泳和第2向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),染色脱色后,分析所得蛋白质斑点。结果:对照组和多发性硬化患者脑脊液2-DE图谱上均可得到近200个蛋白质斑点,其中2个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量增加,4个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量减少,12个蛋白质斑点为多发性硬化患者脑脊液特有。结论:对照组和多发性硬化患者脑脊液的双向电泳图谱存在明显差别,这些发现可为研究多发性硬化疾病机制提供线索。     

子宫肌瘤蛋白质组研究中二维电泳方法的建立

目的:建立并优化用于子宫肌瘤蛋白质组分析的二维电泳技术,提高其分辨率和重复性.方法:以固相pH梯度等电聚焦为第一向,采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,并对关键步骤如样品的溶解、上样量、电泳参数和染色方法进行一系列的优化.结果:获得质量较好的子宫肌瘤和正常肌层的二维电泳图谱.结论:采用蛋白溶解度增强的裂解液分步提取组织的蛋白质,有利于二维电泳图谱的完整性;RC DC蛋白定量方法是二维电泳较为理想的蛋白定量方法,直接关系到上样量;质谱兼容银染法并不降低蛋白斑点的分辨率;窄范围(pH 4～7)的IPG胶条较宽范围(pH 3～10)的IPG胶条具有较高的分辨率.     

幽门螺杆菌蛋白质组双向电泳图谱的构建及其相关技术体系的建立

目的:建立针对幽门螺杆菌蛋白质组学研究的双向电泳及其相关技术体系。方法:分别采用冻融兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10裂解提取法和超声兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10裂解提取法提取Hp菌体蛋白,取100μg菌体蛋白利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳,对硝酸银染色后获得的双向电泳图谱进行图像分析。结果:冻融兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解液一步提取法获得573±29个蛋白斑点,超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解液一步提取法获得921±23个蛋白斑点。结论:超声兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10菌体蛋白提取法提高了双向电泳的分辨率,进而可增强生物质谱鉴定蛋白质的准确度。     

不同时期大动脉炎患者血浆差异表达蛋白的变化

目的 在血浆中筛选与大动脉炎疾病和时期相关的血浆差异表达蛋白.方法 提取各20例大动脉炎急、慢性期患者和20例健康者的血浆进行蛋白双向凝胶电泳,计算机图像软件分析筛选差异性表达的蛋白点,基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱鉴定差异表达蛋白.并对部分蛋白采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中的含量.结果 筛选鉴定出疾病差异表达蛋白14种,包括血清淀粉样蛋白A,血清淀粉样P物质,纤维蛋白原,C3c,C4a,C7,C4结合蛋白,补体因子H-相关蛋白1,α-1酸性糖蛋白,重组激活基因蛋白1(RAG1),载脂蛋白A-Ⅰ、Ⅳ,α1-微球蛋白,转甲状腺素蛋白,结合珠蛋白;其中与大动脉炎不同时期相关的蛋白有血清淀粉样蛋白A、纤维蛋白原、转甲状腺素蛋白、结合珠蛋白.在ELJSA检测中,急性期患者血清中血清淀粉样蛋白A水平(中位数95.9 mg/L)和显著高于慢性期(中位数49.2 mg/L,P=0.009)和健康对照组(中位数23.9 mg/L,P=0.001).急性期补体C4结合蛋白C4BP(中位数88.5 mg/L)显著高于慢性期(中位数61.7mg/L,P=0.023)和正常对照(中位数32.6 mg/L,P=0.001).结论 大动脉患者血浆有多种免疫有关蛋白和急性时相蛋白的表达,有可能用于疾病不同时期的判定;补体激活,补体调节蛋白和自身抗体的产生均参与大动脉炎的免疫病理机制,对这些蛋白的进一步研究有助于阐明大动脉炎的病理机制.     

多囊卵巢综合征蛋白质指纹谱研究

目的:探讨用蛋白质芯片技术筛选多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者血清蛋白质表达谱,寻找血清中的标志性蛋白.方法:采用表面增强激光解离飞行时间质谱技术(surface-enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF MS),运用WCX2(weak cation exchange)蛋白质芯片检测31例PCOS患者和30例正常对照血清蛋白质谱,获得的蛋白质谱采用Biomarker Wizard软件分析,初步筛选蛋白质峰,结合生物信息学的支持向量机(support vector machines,SVM)方法建立并测试PCOS患者的蛋白质指纹图谱模型.结果:在芯片上捕获到225种蛋白质,用质谱仪筛选出PCOS患者与正常对照组相比的23种差异蛋白,从中再次筛选出4种蛋白质组成PCOS的蛋白质谱最优化模型,PCOS患者中质荷比(m/z)分别为6 628,6 430,6 834的3种蛋白质表达上调,m/z为3 954的蛋白质表达下调.模型经三倍交叉验证后用盲法测定,其敏感性和特异性分别为83.3%和86.7%,阳性预测值为87.2%.结论:蛋白质芯片技术可以快速、有效地筛选出PCOS患者血清差异蛋白,结合SVM可建立一个由4种蛋白质组成的蛋白质指纹图谱模型,可对PCOS做很好的诊断预测,对这4种蛋白质尤其是m/z为6 628的蛋白质进行研究,有助于PCOS病因学进展及诊断标记物的发现.     

利用双向凝胶电泳和质谱技术进行前列腺癌差异蛋白质组学研究

目的 分离前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系差异表达蛋白质,为进一步研究前列腺癌的蛋白组学打下基础. 方法 培养前列腺癌雄激素依赖型(LNCaP)和非依赖型(DU145)细胞系,分别提取两种细胞系的总蛋白,进行等电点聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster4.01软件进行分析,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索. 结果 得到了分辨率和重复性均好的前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系的双向凝胶电泳图谱,每块凝胶上平均蛋白质点数为816±15,通过分析得到3倍差异点41个,完全差异点10个.对完全差异点进行质谱分析和数据库检索得到与差异点相对应的3个蛋白质,其中第83号和175号为未命名蛋白质,第632号蛋白质是KIAA1283蛋白质,具有载脂蛋白功能. 结论 在前列腺癌激素依赖型和激素非依赖型细胞系中存在差异表达蛋白质,并可以利用双向凝胶电泳技术进行分离,为进一步研究前列腺癌的蛋白质组学和发病机制提供了线索.     

蛋白质双向电泳技术分析志贺菌诱导耐多药相关蛋白

目的:利用双向电泳技术对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较,寻找耐多药相关蛋白。方法:采用四类抗生素的次抑菌浓度对临床分离鉴定志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验;对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳;电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析。结果:成功获得志贺菌诱导耐多药株,在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出946±37个和1 096±189个蛋白质斑点;经分析共发现48个差异表达的蛋白点。结论:蛋白质双向电泳技术可以成功应用于志贺菌耐多药相关蛋白的筛选,此图谱为进一步研究细菌耐多药机理奠定基础。