抵抗素调节人冠状动脉内皮细胞MMP-9表达机制探讨

目的：探讨抵抗素调节冠状动脉内皮细胞中基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）－9的表达及其机制。方法：用含1%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12培养基培养人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）16 h（血清饥饿培养）,之后随机分为6组：（1）空白对照（Con）组：无抵抗素干预;（2）Res20组：抵抗素20 ng/ml干预;（3）Res40组：抵抗素40 ng/ml干预;（4）Res100组：抵抗素100 ng/ml干预;（5）Res40+U0126组：细胞中加入细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）抑制剂U0126（20 mmol/L）预处理1 h,再加入抵抗素40 ng/ml干预;（6）U0126组：细胞中仅加入ERK抑制剂U0126（20 mmol/L）,细胞各组干预24 h后,用RT-PCR法检测MMP-9和蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）－1 mRNA表达,ELISA法检测MMP-9和TIMP-1蛋白水平,Western blot检测HCAECs p-ERK1/2及ERK1/2的蛋白表达。结果：3种浓度抵抗素干预HCAECs 24 h后,MMP-9 mRNA与蛋白水平均较空白组明显升高（P＜0.05）;TIMP-1 mRNA与蛋白水平均较空白组明显降低（P＜0.05）。40 ng/ml抵抗素干预组加入ERK抑制剂U0126后,MMP-9 mRNA与蛋白水平明显下降（P＜0.05）,TIMP-1 mRNA与蛋白无明显变化。与Con组、U0126组及Res40+U0126组相比,Res40组p-ERK1/2蛋白表达明显增高（P＜0.05）。结论：抵抗素可诱导HCAECs MMP-9的生成,可能通过下调TIMP-1的表达及激活ERK通路参与这一过程。     

2 160例儿童肾穿刺活检术后并发症的治疗及护理

目的：探讨儿童肾穿刺活检（percutaneous renal biopsy,PRB）术后发生相关并发症及治疗方法,总结护理经验和体会,为儿科临床工作提供借鉴。方法：对1999年1月至2012年12月在我院超声科接受PRB的2 160例患儿的临床资料进行回顾性分析,主要包括相关并发症以及并发症的治疗和护理方法等。结果：本组2 160例患儿出现肉眼血尿1 728例（80%）,肾周血肿367 例（17%）,腰痛216例（10%）,尿潴留43例（2%）,肾动脉假性动脉瘤2例（0.1%）,未发生其他脏器损伤或死亡。结论：PRB的开展和推广,有利于提高儿童肾脏疾病的诊治水平,有利于促进儿科肾脏病学的发展。科学的治疗和护理措施,可以有效降低血尿、血肿等并发症的发生率,改善不良预后。     

儿童脓毒症临床特点及预后相关因素分析

目的：分析儿童脓毒症的临床特点及预后,为其早期诊断、治疗提供依据。方法：选择2007年1月至2012年10月在重庆医科大学附属儿童医院住院的105例脓毒症患儿为研究对象,对其临床资料进行回顾性分析。结果：105例脓毒症患儿,男74例（70.5%）,女31例（29.5%）,3岁以内占65.7%。病程中临床表现多样化,易累及多部位感染,可导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）64.8%。最常见的感染部位依次为肺部（92.4%）、皮肤软组织（35.2%）、颅内（32.4%）;最常见的器官功能障碍依次为：呼吸系统（54.3%）、血液系统（50.5%）、肝脏（44.8%）;最常见的原发感染灶依次为肺部（41.9%）、皮肤软组织（21.0%）、消化系统（17.1%）。单因素分析显示器官功能障碍数目（Z=-5.940,P=0.000）、脓毒性休克（χ2=8.531,P=0.003）、白细胞计数（white blood count,WBC）（Z=-2.100,P=0.036）、血小板计数（platelet count,PLT）（Z=-2.925,P=0.003）、降钙素原（procalcitonin,PCT）（Z=-2.125,P=0.034）、D二聚体（D-dimer,DD）（Z=-3.748,P=0.000）、电解质紊乱（χ2=5.899,P=0.015）、入院留取标本1 h后抗菌治疗（χ2=4.594,P=0.032）为影响脓毒症预后的因素。经logistic回归模型检验,仍然与预后相关的因素为器官功能障碍数目（OR=4.256,95%CI=0.112~0.493）及1 h后抗菌治疗（OR=5.027,95%CI=0.048~0.824）。结论：儿童脓毒症中3岁以内婴幼儿居多。临床表现多样化,易累及多部位感染,可导致MODS,最常见的器官功能障碍及感染部位均为呼吸系统,最常见的原发感染灶为肺部。器官功能障碍数增多及1 h后抗菌治疗为导致预后不良的因素。     

超声流量仪对不同孕周新生儿潮气呼吸正常值的测定

目的：建立正常足月儿及不同孕周早产儿潮气呼吸正常值并分析其差异。方法：对55例足月儿、30例晚期早产儿和25例出生胎龄<34周早产儿,在生后1、14日及28日龄,用超声流量仪进行潮气呼吸检测。结果：新生儿期各孕周潮气呼吸功能参数呈正态分布。在第1、14天及28天呼气达峰时间/呼气时间,呼气达峰容积/呼气量,75%、50%、25%潮气量时呼气流速（tidal expiratory flow at 75% remaining tidal volume,TEF75;tidal expiratory flow at 50% remaining tidal volume,TEF50;tidal expira－tory flow at 25% remaining tidal volume,TEF25）值逐渐升高,而呼吸频率（respiratory rate,RR）值则逐渐下降;RR与TEF75、TEF25的相关性在足月儿组为显著相关（r=0.469,0.539,均P<0.01）,在早产儿组为不相关（r=0.190,0.220,均P >0.05）。而晚期早产儿组则RR只与TEF25有相关性（r=0.231,P<0.05）,而与TEF75无相关性（r=0.130,P >0.05）;纠正胎龄40周时,早产儿组潮气呼吸参数TEF25、TEF50、TEF75、潮气量明显低于足月儿组,RR明显高于足月儿组（均P<0.05）,晚期早产儿组同足月儿比较,上述潮气呼吸参数差别无统计学意义（均P >0.05）。结论：新生儿肺功能参数随日龄逐渐改善,在纠正胎龄40周时,小于34周早产儿潮气呼吸参数仍不能达到足月儿组水平。而RR与TEF25、TEF75在足月儿具有相关性,早产儿则未能体现,新生儿潮气呼吸肺功能的测定及相关性分析有助于评估新生儿特别是早产儿的肺发育。不同孕周新生儿潮气呼吸各项指标可作为临床参考正常值。     

铜绿假单胞菌XN-1随机重组子文库的构建及其在疫苗抗原筛选中的应用研究

目的构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)XN-1的全基因组文库,筛选铜绿假单胞菌新的疫苗候选抗原。方法提取我国分离的临床PA XN-1菌株全基因组,Sau3AⅠ酶切成随机片段后经连接至Bam HⅠ酶切后的pMal-c5x载体,转化至X-blue获得随机重组子。随机重组子经IPTG诱导后使用溶菌酶裂解,收集含有融合的麦芽糖结合蛋白(MBP)的随机重组子的裂解上清,制成含有PA全基因组的蛋白随机文库。通过ELISA方法分别检测单个随机文库蛋白的免疫反应性。将经典的PA强反应抗原PcrV做为参照,分别计算单个随机抗原的相对反应强度并进行比较。提取反应较强的重组子的质粒,测定DNA序列后进行翻译和比对,得到整个强反应性抗原的氨基酸信息。结果成功构建PA XN-1的全基因组文库,筛选到强反应性抗原13个,其中4个抗原的反应强度超过PcrV,分别为Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D、Phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase(PtsP)、Phosphate-starvation-inducible E和Very short patch repair endonuclease。结论基于高效表达系统的PA全基因组文库构建成功,可用于PA及其它病原的疫苗候选抗原的筛选研究。     

骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究

目的 探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法 将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况;并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度.结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升;免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达;糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高.BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应.结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用.     

经典P-糖蛋白在儿童淋巴瘤和肾母细胞瘤中的表达及意义

目的：探讨P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）在儿童霍奇金淋巴瘤（Ｈodgkin disease,HL）、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin disease,NHL）和肾母细胞瘤（Wilms’ tumor,WT）中的表达意义,为临床制定个体化疗方案提供理论依据。方法：采用免疫组织化学SP法检测 50 例淋巴瘤（HL 26 例、NHL 24 例）和 32 例ＷＴ中 P-gp 的表达情况及其与临床病理特征的关系。结果：（1）P-gp 在 HL、NHL、WT 中的阳性表达率分别为 57.7%、70.8%、65.6%。（2）HL和 NHL 中 P-gp 的表达差异无统计学意义（P=0.39）,WT 与癌旁对照组中 P-gp 的表达差异无统计学意义（P=1.00）。（3）HL的乳酸脱氢酶的量、有无纵膈病变对P-gp表达的影响有统计学意义（P=0.03、P=0.05）;NHL 的临床分期对 P-gp 的表达影响也有统计学意义（P=0.02）;ＷＴ的组织分型、临床分期、有无淋巴结转移和术前化疗对 P-gp 的表达差异无统计学意义（P=0.53、P=0.25、P=0.64、P=0.45）。结论：（1）P-gp的高表达与儿童HL、NHL和WT的耐药密切相关,是这３种肿瘤预后的不利因素。（2）在临床上可以根据肿瘤耐药蛋白的表达情况针对性地选择化疗药物,使肿瘤患儿用上敏感的化疗药物。     

诱发癫痫持续状态后基质金属蛋白酶-2在小鼠海马与皮层中的表达

目的：观察氯化锂-匹罗卡品所致癫痫持续状态（status epilepticus,SE）小鼠皮层和海马基质金属蛋白酶-2（matrix met－alloproteinases-2,MMP-2）的表达变化,探讨 MMP-2在癫痫发病机制中的作用。方法：选用成年雄性C57/BL6小鼠 48只,并随机分成实验组和对照组。实验组小鼠腹腔注射氯化锂-皮罗卡品制备SE模型,在确定模型成功后8 h采取动物标本进行检测。使用 RT-PCR测定 MMP-2 mRNA含量变化,Western blot检测 MMP-2蛋白表达变化,免疫组化观察 MMP-2分别在海马与皮层的分布规律与特点。结果：（1）海马组织中,对照组与实验组MMP-2 mRNA的表达分别为 0.155 5±0.018 1和 0.743 1±0.014 4,皮层组织中的表达分别为0.204 9±0.018 5和0.871 6±0.037 0,实验组MMP-2 mRNA的表达均比对照组高,差异有统计学意义（t=-45.60,P=0.000;t=-71.83,P=0.000）。（2）MMP-2蛋白水平的表达,在海马组织中分别为 0.084 5±0.009 6和 0.728 4±0.245 1,在皮层组织中对照组与实验组分别为 0.155 6±0.003 9和0.912 5±0.027 7,实验组MMP-2蛋白的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义（t=-76.52,P=0.000;t=-6.99,P=0.000）。（3）免疫组化结果显示,实验组MMP-2在皮层广泛表达,在海马的表达增加主要以 CA1、齿状回、CA3区为主。结论：SE后小鼠海马及皮层内MMP-2在mRNA和蛋白水平的表达均明显升高,表达增加的区域以海马CA1、齿状回及CA3区为主,提示 MMP-2与癫痫的发生、发展可能有着密切的关系。     

儿科重症监护室机械通气患儿下呼吸道与呼吸机管路细菌定植规律的监测及分析

目的：调查分析儿科重症监护室（pediatric intensive care unit,PICU）机械通气（mechanical ventilation,MV）患儿下呼吸道与呼吸机管路细菌定植规律及呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia,VAP）的病原学特点,为VAP的预防和呼吸机管路的科学管理提供依据。方法：目标性监测PICU接受MV治疗的患儿第4天和第7天VAP发生情况,分析其下呼吸道和呼吸机管路的细菌定植规律及与MV时间的关系。结果：MV第4天组和第7天组在VAP发生率（P<0.05）、Y型接口处和冷凝水的细菌培养阳性率及菌落数（P<0.05）、下呼吸道和呼吸机管路细菌培养的一致性比较差异有统计学意义（P<0.05）。阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和白色假丝酵母菌（39.2%）为导致VAP的主要菌群,阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌（47.3%）为呼吸机管路的最主要定植菌群。结论：VAP的病原学与呼吸机管路细菌定植密切相关,MV时间和细菌定植规律影响VAP的发生。尽早脱机、关注Y型接口处的细菌污染、规范化管理冷凝水以及有效控制呼吸机管路的细菌定植对临床预防VAP有重要意义。     

组蛋白H3高乙酰化对心脏相关转录因子Islet-1的调控作用

目的：探讨组蛋白H3乙酰化修饰对心脏发育早期相关转录因子胰岛素基因增强结合蛋白1（Insulin gene enhancer protein 1,Islet-1）的调控作用。方法：体外培养心肌祖细胞,分别用不同浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA）干预（0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L）,噻唑蓝（Methyl thiazoyl tetrazolium,MTT）比色实验检测SAHA对细胞增殖的影响,筛选出SAHA的合适干预浓度,用Western blot技术检测心肌祖细胞组蛋白H3乙酰化状态,Real-time PCR检测Islet-1的mRNA表达水平变化,染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）Real-time PCR技术检测Islet-1启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果：SAHA 0.5、1.0 μmol/L处理组较对照组细胞增殖率有所提高,但差异没有统计学意义（P >0.05）,SAHA 2.0 μmol/L处理组与对照组细胞增殖率相当（P >0.05）。SAHA 4.0 μmol/L处理组与对照组比较,细胞增殖受到抑制（P<0.05）。SAHA 2.0 μmol/L处理48 h后心肌祖细胞H3乙酰化水平与对照组比升高7.23倍（P<0.05）。Islet-1的mRNA表达与对照组比提高了4.68倍（P<0.05）,Islet-1启动子区组蛋白H3乙酰化水平是对照组的2.08倍（P<0.05）。结论：在心肌祖细胞中,组蛋白H3高乙酰化水平促进Islet-1表达,Islet-1受到组蛋白H3乙酰化调控。