乳铁蛋白对脂多糖激活的U937细胞TLR4信号通路相关膜分子表达的影响

目的:研究重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rh LF)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的U937细胞Toll样受体4(toll-like receptors 4,TLR4)信号通路相关膜分子TLR4、CD14、MD2表达的影响。方法:经佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导成熟的U937细胞随机分为6组:对照组、LPS组(给予100 ng/ml LPS)、LPS+50μg/ml rh LF组、LPS+100μg/ml rh LF组、LPS+200μg/ml rh LF组、LPS+500μg/ml rh LF组,采用RT-PCR和Western blot检测各组细胞TLR4、CD14、MD2 m RNA和蛋白的表达,ELISA检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。结果:LPS组U937细胞TLR4、CD14、MD2 m RNA和蛋白的表达均明显高于对照组(P<0.05),LPS+50μg/ml rh LF组三者m RNA和蛋白的表达与LPS组差异不明显(P>0.05),LPS+100μg/ml rh LF组、LPS+200μg/ml rh LF组、LPS+500μg/ml rh LF组均明显降低了LPS诱导的TLR4、CD14、MD2 m RNA和蛋白的表达(P<0.05);LPS组TNF-α的含量明显高于对照组(P<0.05),LPS+50μg/ml rh LF组、LPS+100μg/ml rh LF组、LPS+200μg/ml rh LF组、LPS+500μg/ml rh LF组均明显降低了LPS诱导的TNF-α的产生(P<0.05)。结论:rh LF通过抑制TLR4介导的LPS跨膜信号转导和炎症因子TNF-α的分泌,对LPS所致的脓毒血症具有潜在的治疗作用。     

IL-31和他克莫司对Hacat细胞NT4表达的影响

目的:探讨白介素-31(interleukin-31,IL-31)、他克莫司对角质形成细胞神经营养素-4(neurotrophin-4,NT4)表达的影响。方法:培养人角质形成细胞株(Hacat细胞),采用不同浓度他克莫司作用24 h,噻唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖活性。IL-31、他克莫司单独或共同作用于Hacat细胞24 h后,采用real-time PCR法检测NT4 m RNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测12、24 h各组细胞上清液中NT4含量。结果:低浓度他克莫司(10、100)ng/ml对细胞活性无明显影响(P>0.05),高浓度(1 000 ng/ml)时细胞活性受到抑制(P=0.002)。IL-31作用Hacat细胞后,其NT4m RNA表达和上清中NT4含量均增加(P<0.05);100 ng/ml他克莫司作用24 h后他克莫司组和联合作用组细胞NT4 m RNA表达量和细胞上清中NT4含量均分别低于对照组和IL-31组(P<0.05)。结论:IL-31可促进角质形成细胞NT4表达,他克莫司可能通过降低角质形成细胞NT4表达水平而发挥其抗瘙痒作用。     

白血病细胞中Beta-Arrestin1与EZH2分子结合研究

目的：检测急性淋巴细胞白血病细胞（acute lymphoblastic leukemia,ALL）CCRF-CEM和Raji细胞中Beta-抑制蛋白1（Beta-Arrestin1）与Zeste增强子同源物-2蛋白（enhancer of Zeste homolog 2,EZH2）是否存在结合。方法：白血病细胞中,Western blot检测Beta-Arrestin1与EZH2表达水平,激光共聚焦（Confocal）检测 Beta-Arrestin1与EZH2在细胞中的位置与共定位;免疫共沉淀（CO-IP）检测Beta-Arrestin1与EZH2结合能力。结果：Beta-Arrestin1与EZH2在白血病K562、CCRF-CEM和Raji细胞中均有表达。激光共聚焦结果显示Beta-Arrestin1与EZH2均在K562、CCRF-CEM和Raji细胞内共定位,CO-IP结果显示在K562,CCRF-CEM和Raji细胞中Beta-Arrestin1与EZH2结合。结论：在CCRF-CEM和Raji中,Beta-Arrestin1可与EZH2结合。     

穿心莲内酯对临床铜绿假单胞菌感染人支气管上皮细胞的干预研究

目的：用铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,PA）感染人支气管上皮细胞BEAS-2B,观察穿心莲内酯对细菌感染性肺炎及其诱发的宿主细胞炎性反应的影响。方法：PA标准株PAO1和临床分离株Cq1（exoU-）及Cq40（exoU+）感染上皮细胞BEAS-2B;体外肉汤培养观察穿心莲内酯（浓度300 μmol/L）对细菌生长的影响。侵袭实验、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放实验、菌落计数法检测PA对BEAS-2B细胞的侵袭力;ELISA法检测BEAS-2B细胞炎症因子白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-8的表达水平。穿心莲内酯（3.0 μmol/L和4.5 μmol/L）用于对PA感染人BEAS-2B的干预实验。结果：同PAO1相似,PACq1及Cq40在LB培养基中的生长均不受高浓度（300 μmol/L）穿心莲内酯影响。但穿心莲内酯（3.0 μmol/L和4.5 μmol/L）降低侵入胞内的PA数,减少细菌感染所致的上皮细胞LDH释放,也降低了细菌刺激上皮细胞IL-6及IL-8的表达水平。结论：穿心莲内酯可降低PA临床分离株对人支气管上皮细胞的侵袭力,并可降低细胞损伤及抑制细胞炎症反应。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

基因芯片筛选非综合征型唇腭裂差异表达基因的初步研究

目的：利用全基因组表达谱芯片技术,分析非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without palate,NSCL/P）患儿与正常儿童基因表达的差异,筛选出非综合征型唇腭相关基因。方法：采用离心柱法分别提取正常儿童和NSCL/P患儿腭部组织各3例的总RNA,经纯化后逆转录为cDNA,利用荧光染料（Cy3）标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,经纯化及质检后与Agilent 4 × 44 k人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验筛选差异表达基因,采用上海博豪生物在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,选取特定的差异表达基因,应用实时荧光PCR技术验证芯片结果的可靠性。结果：筛选出差异基因共254个,其中表达上调的有151个,表达下调的有103个。选取5条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,ADH1C（t=5.132,P=0.000）、RDH10（t=2.960,P=0.039）、HIST1H2BD（t=4.446,P=0.001）3条基因表达下调,KAT2B（t=-4.945,P=0.000）、FOSB（t=-3.666,P=0.005）2条基因表达上调,差异有统计学意义,且与芯片结果表达趋势一致。结论：NSCL/P患儿基因表达与正常儿童存在明显差异,分析这些差异基因,有助于阐明NSCL/P的发病机制,为疾病的预防提供理论依据。     

软组织重建治疗Wassel Ⅳ-D型复拇畸形术后继发性畸形

目的 探讨儿童Wassel Ⅳ-D复拇畸形术后继发性畸形的有效治疗方法.方法 2007年12月至2011年10月,对9例Wassel Ⅳ-D型复拇畸形术后发生继发性畸形患儿进行软组织重建:术中对组织结构进行解剖,观察屈肌腱结构及走向、骨关节的解剖结构,并行肌腱止点移位,A2滑车重建,关节囊松解和紧缩,大鱼际肌止点移位.术后克氏针固定4～5周,支具固定3个月.结果 术中发现9例均存在指间关节桡侧皮肤挛缩,拇指末节桡偏,关节囊桡侧挛缩,尺侧松弛;拇长屈肌腱位于近节指骨桡侧偏前,无鞘管包裹,A2滑车缺如;拇长屈肌腱止点附着于拇指末节基底,其中1/3居中,2/3位于桡侧;拇指末节向桡侧旋转10°～15°.术后随访6～38个月,平均24个月,根据Tada等制定的标准评价:优7例,良1例,差1例.结论 采用软组织重建可以有效地治疗Wassel Ⅳ-D型复拇畸形术后继发性畸形,拔除克氏针后支具的使用,对防止继发畸形具有重要的作用.     

Th1/Th9/Th17细胞失衡对实验性自身免疫性重症肌无力幼鼠的影响及机制初探

目的：对实验性自身免疫性重症肌无力（myasthenia gravis,MG）幼鼠采用双类似物（Lys262-Ala207）经鼻黏膜诱导免疫耐受后,了解实验幼鼠Th1/Th17/Th9细胞及产生相关细胞因子的细胞变化情况及其与EAMG幼鼠发病的相关性,探讨其调控作用机制。方法：将30只幼年雌性C57BL/6小鼠采用完全随机分组方法分为3组：模型组、耐受组和对照组。模型组经腹腔注射含1.0 mg/kg mAb35的Ringer’s 液0.2 ml,建立EAMG模型;耐受组在致敏前10 d先经鼻黏膜滴入Lys262-Ala207诱导黏膜耐受,再按照模型组方式进行处理;对照组注射不含mAb35的Ringer’s缓冲液 0.2 ml。采用流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞中分别代表Th1/Th17/Th9细胞功能的CD4+ 干扰素（interferon,IFN）-γ+ 细胞、CD4+ 白介素（interleukin,IL）-17+ 细胞和CD4+ IL-9+ 细胞的含量。采用双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-17、IL-9的水平。结果：（1）MG的临床表现对照组明显轻于模型组和耐受组,而耐受组经双类似物免疫耐受后,其临床症状也较模型组明显减轻。（2）模型组、耐受组和对照组的CD4+ IFN-γ+ 细胞含量3组间比较差异有统计学意义（P＝0.0０）,即：模型组分别比耐受组和对照组高（P＝0.0０）,而耐受组也比对照组高（P＝0.0０）;（3）模型组、耐受组和对照组的CD4+ IL-17+ 细胞含量3组间比较差异有统计学意义（P＝0.0０）,即：模型组分别比耐受组和对照组高（P＝0.0０）,而耐受组也比对照组高（P＝0.0０）;（4）模型组、耐受组和对照组的CD4+ IL-9+ 细胞含量3组间比较差异有统计学意义（P＝0.0０）,即：模型组分别比耐受组和对照组高（P＝0.0０）,而耐受组也比对照组高（P＝0.00）。（5）模型组、耐受组和对照组的脾细胞上清中细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-9的水平3组间比较差异有统计学意义（P＝0.00）,即：模型组分别比耐受组和对照组高（P＝0.0０）,而耐受组也比对照组高（P＝0.0０）。结论：采用Lys262-Ala207对实验幼鼠进行鼻黏膜耐受后不仅能有效的缓解其MG的临床症状,同时还能下调导致实验幼鼠发病的CD4+ IFN-γ+ 细胞、CD4+ IL-17+ 细胞和CD4+ IL-9+ 细胞含量水平以及细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-9的水平,缓解Th1/Th17/Th9细胞功能失衡现象,从而达到预防和减轻实验幼鼠发病的作用。     

高通量测序分析5例母婴传播中HBV准种变化趋势

目的：探讨5例乙肝疫苗接种失败儿童及其母亲在母婴传播过程中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）“a”决定簇准种变化趋势。方法：选择5例重庆地区乙肝疫苗接种失败的儿童及其母亲,应用PCR法扩增其HBV基因组全长,构建HBV全基因组测序文库后进行solexa高通量测序,并对测序数据进行生物信息学分析。结果：母子HBV序列同源性为99%～100%;5对母子HBV基因型均为B+C混合型,其中4对优势基因型为B型,1对为C型,母子优势基因型相同;所有儿童均在“a”决定簇存在复杂度明显增高位点;5对母子“a”决定簇复杂度明显增高的氨基酸（Amino acid,aa）位点共有10个,仅存在于儿童的有2个,为aa126和aa143,儿童中有1例发生优势氨基酸突变,突变形式为G145R。结论：乙肝疫苗接种失败儿童在“a”决定簇存在准种现象,儿童体内的突变株可能来源于其母亲。