南京地区鲍氏不动杆菌AmpC酶、β-内酰胺酶基因研究

目的了解南京地区多药耐药鲍氏不动杆菌（ABA）临床分离株AmpC酶和β-内酰胺酶基因存在状况。方法自2007年7-10月南京地区住院患者标本中分离出20株多药耐药鲍氏不动杆菌,微量肉汤稀释法测定11种抗菌药物的敏感性,聚合酶链反应（PCR）法测定多药耐药鲍氏不动杆菌2种AmpC酶及18种β-内酰胺酶基因。结果20株ABA AmpC染色体型基因阳性14株（70.0%）、AmpC质粒型基因阳性1株（5.0%）;TEM基因阳性12株（60.0%）、SHV基因阳性1株（5.0%）、CTX-M-1群基因阳性2株（10.0%）、OXA-23群基因阳性1株（5.0%）、OXA-24群基因阳性1株（5.0%）,经测序BLASTn比对为OXA-72型;16、17号株测得AmpC（染色体型）DNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的AmpC（染色体型）序列比较分别有两个和1个氨基酸差别,均为新亚型。结论南京地区ABA除可携带TEM、VEB、GESI、MP、VIM、OXA-10、OXA-23基因外,还可携带AmpC染色体型及AmpC质粒型、SHV、CTX-M-1群、OXA-24群基因。同时进行AmpC活性与AmpC染色体型、质粒型基因配对检测为国内首次。     

2002～2003年南京地区流感病毒的分离与分子生物学鉴定

目的:从南京流感样患者中分离流感病毒并通过分子生物学方法鉴定,为研究南京地区流感病毒基因变异特点提供基础。方法:将流感样患者咽拭子接种狗肾传带细胞,筛选血凝阳性细胞培养上清,以甲、乙型流感病毒型及甲1、甲3亚型特异性引物通过RT-PCR方法鉴定并分型和亚型,用血凝抑制试验证实。结果:13份标本中血凝阳性为8份,甲型流感病毒型特异性引物RT-PCR扩增结果4株为阳性,且均为甲3型;乙型流感病毒型特异性引物RT-PCR结果2株为阳性。血凝抑制试验支持此结果。结论:从南京地区流感样患者中成功地分离并鉴定了6株流感病毒。     

莲必治注射液(穿心莲内酯)对免疫功能的调节作用

目的 :研究穿心莲内酯对免疫功能的影响 ,探索其发挥治疗作用的免疫机制。方法 :采用生物活性法和ELISA法检测用有效成分为穿心莲内酯的莲必治注射液处理人外周血单个核细胞上清中的IFN-α ,IFN-γ ,TNF-α,IL-8含量 ;用单核巨噬细胞吞噬鸡红细胞来研究其促吞噬功能及用LDH释放法检测其对NK细胞杀伤活性的影响。结果 :和空白对照组比 ,莲必治注射液作用外周血单个核细胞能显著诱导IFN-α ,IFN γ ,TNF-α产生 (P<0.05) ,但对IL-8诱生无明显影响 ,甚至轻度抑制。莲必治注射液能提高 豚鼠腹腔单核巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率 (P<0.05)及提高人外周血中NK细胞杀伤K562 细胞的活性 (P<0.05)。结论 :穿心莲内酯是一种具有调节机体非特异免疫功能的免疫刺激剂 ,通过对NK ,MΦ及细胞因子分泌的影响而发挥免疫调节作用。     

雷公藤多甙和IL-10对人DC内IL-12p40和DCCK1 mRNA转录的影响

目的 :研究雷公藤多甙和IL 10对DC内IL 12p40和DC CK1转录的影响。方法 :通过GM CSF、IL 4和TNFα体外培养体系 ,从人外周血单个核细胞中诱导DC ,IL 12p40和DC衍生的趋化因子 1(DC CK1)转录采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术。结果 :通过GM CSF、IL 4和TNFα体外培养体系可以获得成熟功能性DC ,雷公藤多甙和IL 10能抑制DC内IL 12p40mRNA的转录 ,但对DC CK1mRNA的转录无明显影响。结论 :雷公藤多甙、IL 10可能通过抑制IL 12p40mR NA的转录而干扰DC的功能     

稳定表达人类疱疹病毒6型U94基因血管内皮细胞株的建立及U94对内皮细胞增殖和血管生成能力的影响

目的:构建人类疱疹病毒6型U94基因慢病毒载体,研究U94基因对血管内皮细胞增殖及血管生成的影响?方法:以质粒pSR2PH－U94为模板,PCR扩增U94－6×His片段,克隆至慢病毒载体pLenti6.3－MCS－IRES2－EGFP,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,获得含U94－6×His基因的重组慢病毒?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,经Blasticidin筛选,RT－PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达细胞株?CCK－8和小管形成实验研究U94基因对血管内皮细胞的增殖及血管生成能力的影响?结果:成功构建含U94基因的慢病毒表达载体pLenti－U94－IRES2－EGFP,重组慢病毒经包装?纯化后测得滴度为2.35 × 107 TU/ml?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,获得能稳定表达U94基因的细胞株EA.hy926－U94?CCK－8及小管形成实验结果显示EA.hy926－U94细胞与阴性对照细胞EA.hy926－NC?正常EA.hy926细胞相比,细胞增殖活性明显降低,小管形成能力变差?结论:成功建立了慢病毒介导的稳定表达U94基因的血管内皮细胞株,研究表明U94可以抑制内皮细胞的增殖及血管生成?     

人类疱疹病毒6A亚型DR7基因对神经胶质瘤细胞U87增殖､迁移､侵袭能力的影响

目的:构建含人类疱疹病毒6A亚型DR7基因的慢病毒,研究DR7基因表达对神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移?侵袭能力的影响?方法:PCR扩增DR7基因,克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP,构建pLenti6.3-DR7-IRES2-EGFP重组慢病毒载体,经293T细胞包装重组病毒转染至神经胶质瘤细胞U87,经blasticidin筛选建立稳定表达株,通过细胞增殖实验?细胞周期实验?细胞划痕及Transwell实验研究稳定表达DR7基因对U87细胞的增殖?迁移及侵袭能力的影响?结果:成功构建了pLenti6.3-DR7-6 × His-IRES2-EGFP慢病毒表达载体,筛选了稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞株,CCK-8细胞增殖实验显示,稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞与阴性对照细胞U87-NC-EGFP?U87细胞相比,细胞增殖活性明显增高,差异具有统计学意义(P < 0.001)?细胞周期检测发现U87-DR7-EGFP细胞S?G2/M期细胞所占比例多于U87-NC-EGFP?U87细胞:S期的比例分别为(34.73 ± 1.12)%?(24.89 ± 0.93)%?(25.39 ± 0.96)%,差异具有统计学意义(P < 0.001);G2/M期分别为(17.35 ± 1.61)%?(11.36 ± 1.50)%?(13.17 ± 1.95)%,差异具有统计学意义(P < 0.05)?细胞划痕实验表明,U87-DR7-EGFP细胞愈合能力明显强于U87-NC-EGFP?U87细胞,划痕6 h愈合率分别为:(33.55 ± 2.83)%?(23.50 ± 3.18)%?(22.03 ± 1.47)%,差异具有统计学意义(P < 0.01);划痕12 h愈合率分别为(70.50 ± 5.39)%?(53.60 ± 4.67)%?(55.09 ± 2.83)%,差异具有统计学意义(P < 0.001)?Transwell实验表明,U87-DR7-EGFP细胞的穿膜数量明显多于U87-NC-EGFP?U87细胞,分别为:(543.00 ± 22.94)?(387.00 ± 15.63)?(412.00 ± 20.30)个,差异具有统计学意义(P < 0.001)?结论:人类疱疹病毒6A亚型DR7基因表达能在体外促进人神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移及侵袭,提示其在神经胶质瘤的发生和发展中可能起一定作用?     

心肌损伤修复实验指标:MyoD基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景:MyoD基因是肌肉转录因子家族成员之一,转染MyoD基因可以启动肌分化过程,使非肌细胞转变为肌细胞。MyoD基因仅在骨骼肌表达,基于心肌细胞和骨骼肌细胞有相同的收缩装置,可以设想将外源MyoD基因诱导坏死心肌局部的成纤维细胞向具收缩功能的骨骼肌细胞转化,可能会成为临床治疗心衰的又一种方法。目的:构建和鉴定MyoD基因重组腺病毒载体,为研究MyoD对心肌损伤的修复作用提供试验基础。设计:单一样本实验。单位:南京医科大学第一附属医院心脏科。材料:实验于2004-09/2005-09在南京医科大学微生物学与免疫学实验室完成。以MyoD基因和非复制型腺病毒表达载体为研究对象。方法:从pEMSV-MyoD质粒上用聚合酶链反应法扩增出MyoDcDNA片段,再通过聚合酶链反应使MyoD基因加上CACC序列接头,经过定向拓扑克隆使目的基因连接到转移载体上,再通过LR酶促反应,将目的基因转移到腺病毒表达载体DNA上,获得MyoD基因重组的腺病毒DNA,用脂质体转染法转染HEK293A细胞,包装扩增出MyoD基因重组的腺病毒。主要观察指标:聚合酶链反应鉴定和DNA测序来证实MyoDcDNA片段大小和序列的正确性,并测定病毒滴度。结果:经聚合酶链反应鉴定和DNA测序证实MyoD基因重组腺病毒含大小正确的目的片段,其DNA序列正确。病毒滴度为1.3×1011pfu/mL。结论:成功构建了MyoD基因重组腺病毒载体。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

EB病毒LMP2A在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达及意义

目的：观察EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在鼻咽癌(NPC)患者肿瘤组织中的表达，探讨采用LMP2A作为靶抗原进行NPC免疫治疗的可行性。方法：采用SP免疫组织化学方法，检测40例NPC组织及38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本LMP2A的表达。结果：40例NPC标本中36例LMP2A表达阳性(90．0％)；LMP2A的表达与NPC病理分化程度无明显相关性。38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本中33例LMP2A阴性反应，5例阳性反应。鼻咽黏膜慢性炎组织与NPC组织中LMP2A阳性表达率间差异存在统计学意义。结论：在不同病理分化程度的NPC肿瘤组织中LMP2A均可广泛表达，在正常鼻咽组织细胞中基本不表达。采用LMP2A作为靶抗原诱导机体特异性细胞免疫反应杀伤NPC肿瘤细胞具一定可行性。     

抗人类疱疹病毒６型南京分离株Ｅ５单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定人疱疹病毒6型(HHV-6)单克隆抗体.方法:用纯化的HHV,6南京分离株E5免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/O融合,经间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法、免疫印迹实验等方法鉴定单抗.并采用套式PCR法和ELISA法,在口腔癌中进行了初步的应用.结果:获得了一株分泌抗HHV-6单克隆抗体的杂交瘤细胞系,命名为JA9.单克隆抗体亚类鉴定表明:其为IgGl亚类,轻链为K.用间接ELISA法检测细胞上清单抗效价为1:500;单抗腹水滴度为1:8.0×104.免疫印迹实验结果表明:JA9单抗腹水与约75 ku HHV-6 E5病毒蛋白结合.口腔癌患者唾液的HHV-6阳性检测率结果分别是:套式PCR法60%.ELISA法40%.结论:成功制备并鉴定一株抗HHV-6南京分离株E5单克隆抗体,为HHV-6进一步的基础研究及临床快速诊断提供可能.