HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ     

表达载体pRSET C重组rhTNF—β的表达及其纯化

将ｈＴＮＦ－β Ｎ端缺失２３个氨基酸的基因,克隆在表达载体ｐＲＳＥＴ Ｃ的６个组氨酸序列和肠激酶酶切位点序列的下游,以重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,经ＩＰＴＧ诱导,ｒｈＴＮＦ－β获得了高表达,表达量占细胞总蛋白的２６％,其表达产物大部分以可溶性形式形成。菌体裂解上清经０．４５μｍ的滤膜过滤后,用固定化金属配体亲和柱层析,纯度可达９５％左右;经肠激酶酶切后,具有ＴＮＦ－β的细胞毒活性,此活     

hTNF-α单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列及分子结构分析

从两株具有高亲和力及中和活性的抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基础。     

重组人Ⅱ型胶原蛋白免疫原性多肽表达的研究

目的 构建编码人Ⅱ型胶原蛋白250-270多肽片段（HuCⅡ250-270)的多聚基因，以获得高效表达，高度可溶和便于纯化的重组多肽基因。方法 选用大肠杆菌（E.coli)偏爱密码子优化HuCⅡ250-270的基因组成，通过化学合成和PCR法，获得HuCⅡ250-270的基因，并利用BanHI和BglⅡ同裂酶进行酶切位点串联获得6聚体，对影响重组HuCⅡ250-270表达的各种因素进行系统研究，以获得优化表达的条件，对表达产物进行分离纯化。结果 酶切分析和DNA测序证实，6聚目的基因的构建正确，融合表达的量明显高于非融合表达，在优化条件下，可达30%，表达产物的可溶性明显提高（在90%以上），其相对分子质量（Mr)与预期的相符，纯化后的纯度达90%以上。结论 实现了HuCⅡ250-270的高效表达，为研究类风湿性关节炎的发病机制和治疗提供了实验依据。为在原核细胞中高效表达的胶原蛋白的功能性小片段，提供了可供参考的借鉴。     

MTT比色法测定7株抗hIL-5mAb对TF-1细胞的增殖抑制活性

利用人红白血病细胞系（ＴＦ－１）细胞具有对ｈＩＬ－５依赖生长的特性，采用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法〔１〕对所制备的抗ｈＩＬ－５ｍＡｂ进行活性测定。１材料与方法１．１细胞和试剂ＴＦ－１由中国科学院上海生物工程研究中心保存，ｈＩＬ－５标准品为英国Ｐｅｒｏ...     

甲状旁腺素1-34肽的固相合成

目的以Wang树脂为载体 ,应用芴甲氧羧基 /tBu方法合成人甲状旁腺素。方法芴甲氧羧基保护氨基酸用 1 氧 3 双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐 / 1 羧基苯并三氮唑活化后 ,进行缩合反应。合成的多肽用三氟乙酸处理 ,从Wang树脂上切除。所得粗肽用SP Sepharose FF色谱柱和半制备型高效液相色谱分离纯化。结果用反相高效液相色谱法和毛细管电泳法鉴定纯度在 92 %以上。通过电喷雾质谱法测定其分子量为 4 1 1 6D ,与计算值相符。总收率为 8%。结论此工艺简单 ,易于扩大 ,适合于规模化生产     

乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的　用含乙型肝炎病毒 (HBV)前 S区不同大小的c DNA片段构建酵母双杂交诱饵载体 ,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用 .方法　PCR扩增含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,分别克隆入 p U C19质粒 ,经测序正确后 ,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体 p GBKT7中 .将重组质粒导入酵母菌 AH10 9,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用 .结果　成功获得含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,HBV前 S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌 AH10 9无毒性 ,但是对报告基因均有激活作用 .结论　不能利用酵母双杂交 Gal4系统 3来研究与 HBV前 S区相互作用的蛋白 ;证实了 HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能 ,为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础     

带PSA启动子的hytk基因在前列腺癌细胞中的表达

目的　构建人前列腺组织特异性的hytk基因治疗载体并探讨其临床意义。 　方法　将PSA启动子序列替代含hytk基因的真核表达载体tgCMV/hytk中的CMV启动子序列 ,应用Fu GENETM6系统转染前列腺癌细胞株并检测hytk基因的表达情况 ,MTT法检测GCV(丙氧鸟苷 )的毒性作用。　结果　成功获得带PSA启动子的真核表达载体tgPSA/hytk ,PCR、RNADotBlotting及WesternBlotting检测显示hytk基因仅在PSA阳性前列腺癌细胞株LNCaP细胞中表达 ,且转染hytk基因的LNCaP细胞对GCV敏感。　结论　含有PSA启动子的hytk真核表达载体是前列腺癌基因治疗的新型、理想候选载体     

新型重组人肿瘤坏死因子工程菌的发酵工艺研究

目的研究并建立新型重组人肿瘤坏死因子 (nrhTNF)的发酵工艺。方法通过探讨nrhTNF工程菌在试管和锥形摇瓶中的生长和表达规律 ,筛选并确定其最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件 ,然后在 5L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果nrhTNF工程菌在 5L发酵罐中培养至终密度A60 0nm30左右时 ,目的蛋白的表达最高 ,保持在菌体总蛋白的 5 0 %附近 ,发酵时间为 12～ 13h。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为nrhTNF的工业化生产奠定了基础。     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子融合蛋白原核高效表达质粒的构建与表达

将人γ干扰素/β肿瘤坏死因子融合蛋白(hIFN-γ/TNF-β,rhTNF-β)是一种颇具理论研究价值和临床应用前景的新型细胞因子.鉴于现有的rhTNF-β表达质粒的表达水平较低(1%左右),不能满足研究工作的需要.本工作在过去构建rhTNF-β表达质粒的基础上,采用分步构建的方式,首先构建了该融合蛋白基因5’端部分的人γ干扰素突变体(hIFN-γ134-X13)编码序列的表达质粒,在获得高效表达以后,再在其3’端连接上5’端缺失23个氨基酸残基(aa)的人β肿瘤坏死因子(hTNF-β148)的核酸序列,进行整个融合蛋白基因的表达研究.实验结果表明,新构建的rhTNF-β表达质粒经转化大肠杆菌BL21(DE3),在λP_RP_L启动子的控制下,温敏诱导表