不同居群草珊瑚的ITS序列分析及模式识别研究

目的 通过分析不同居群草珊瑚Sarcandra glabra和金粟兰属5种近缘植物的核糖体基因内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,为草珊瑚鉴定和品种鉴别提供模式识别与思路。方法 采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份,所有样品提取总DNA,并对其ITS片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的其他4种金粟兰属植物的ITS序列,运用ClustalX 2.1软件比较不同产地草珊瑚与其他金粟兰属植物的ITS序列差异,并对其进行聚类分析。结果 草珊瑚样品不同居群间的ITS序列相似度达99%,其中位点总突变率ITS1(2.7%)>ITS2(1.4%),而与金粟兰属其他植物相比,位点总突变率ITS2(20.3%~22.7%)>ITS1(15.9%~18.3%)。聚类分析表明18个不同种群的草珊瑚居群间变异极小,且与金粟兰属5种近缘植物具有显著差异的聚类识别。结论 草珊瑚ITS1与ITS2分别为不同居群间及与不同属近缘植物间比较有效的鉴别序列,具有较多个特异性信息位点的草珊瑚ITS序列用于鉴别金粟兰属5种近缘植物,具显著差异的聚类识别,是草珊瑚和金粟兰属近缘植物鉴定和品种鉴别的有效分子标记。     

不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析

为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异,采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌,通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定,共分离得到152株内生真菌,分属于8个属,其中Phomopsis,Diaporthe,Alternaria为3个产地内生真菌共有属,各产地的优势种群不同。相似性分析表明,不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异;多样性及均匀度分析表明,慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高,分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低,优势种群集中,奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析,不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。综合分析认为,杜仲皮组织的内生真菌具有多样性,慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异。     

基于DNA条形码-产地-形态联用的药材溯源新方法研究——以黑果枸杞1种伪品为例

利用NCBI核酸数据库中ITS (internal transcribed spacer) 序列, 结合产地分析和形态分析对新发现的一种黑果枸杞混伪品进行溯源研究。通过提取样品DNA, PCR扩增及双向测序, 获得样品的ITS序列。所得序列用ContingExpress软件进行拼接, 截取ITS序列全长;利用 NCBI核酸数据库中已登录的ITS序列进行相似度分析对其进行DNA条码溯源;根据其产地分析DNA条形码溯源结果;再根据形态特征进一步验证结果, 3种方法联用获得溯源结果。新发现的黑果枸杞混伪品来源于小檗科小檗属植物喀什小檗Berberis kaschgarica。与黑果枸杞的主要区别:喀什小檗果实表面平滑, 质地轻脆, 黑果枸杞表面皱缩, 质地坚实而硬;喀什小檗外果皮细胞壁连珠状增厚, 石细胞壁平直, 层纹不明显, 黑果枸杞外果皮细胞壁不增厚, 石细胞壁波浪状, 层纹明显;喀什小檗的ITS序列长度为606 bp, 黑果枸杞的长度为654 bp, 二者序列对齐后的相似度为53.32%。     

大学生人际信任与主观幸福感相关性研究

目的探讨大学生人际信任与主观幸福感的相关性。方法对176名大学生采用人际信任量表和总体幸福感量表进行测评分析。结果大学生人际信任量表总分与总体幸福感量表总分呈显著正相关（P〈0．01）,与抑郁心境、对情感与行为的控制、焦虑因子分呈显著负相关（P〈O．05或0．01）。结论大学生的人际信任与主观幸福感有密切联系,人际关系困扰越严重的大学生,其主观幸福感程度越低。     

铁线莲属8种药用植物ITS序列分析

目的 通过测定并比较柱果铁线莲、单叶铁线莲、威灵仙、山木通、毛蕊铁线莲、转子莲、女萎和天台铁线莲的ITS序列,为铁线莲属药用植物的分子鉴定提供依据。方法 利用PCR法从叶片基因组DNA中扩增ITS,借助Clustal X、MEGA、DNASTAR等软件比较和分析ITS的序列特征。结果 铁线莲属8种药用植物ITS1与ITS2之间的长度为534～561 bp,变异位点50个,信息位点22个;天台铁线莲与转子莲的遗传距离最小,与女萎遗传距离最大,亲缘关系最远。序列已提交至NCBI数据库,登录号为JF714638－JF714645。结论 获得铁线莲属8种药用植物的ITS序列,为分子鉴定奠定了基础。     

广西褐家鼠感染路氏锥虫分子生物学鉴定及系统发育分析

目的对广西部分地区褐家鼠感染的路氏锥虫进行分子生物学鉴定,分析不同地理种群间的遗传分化。方法从广西靖西、百色、南宁、天峨4地感染路氏锥虫的褐家鼠脾脏或血凝块中提取DNA,设计ITS1保守引物进行PCR扩增,将PCR产物直接或克隆测序。用DNAstar7.1进行同源性比对,用Mega4.0进行差异分析与聚类、构建系统进化树。结果广西各地血涂片阳性鼠标本均扩增出特异性DNA条带,4地样品测序结果与GenBank上登录的路氏锥虫（T.lewisi）序列的同源性均高达96%以上。区内各地理种群之间遗传距离均在0.021以下,与其他3个近缘种T.otospermophili、T.grosi、T.kuseli间遗传距离为0.15～0.206。结论广西4地鼠感染的锥虫为路氏锥虫。ITS1可以作为路氏锥虫的种属分类和分子诊断的标记。     

Origin and evolution of the worldwide distributed pathogenic amoeboflagellate Naegleria fowleri

Naegleria fowleri, a worldwide distributed pathogen, is the causative agent of primary amoebic meningoencephalitis. Because it is such a fulminant disease, most patients do not survive the infection. This pathogen is a free-living amoeboflagellate present in warm water. To date, it is well established that there are several types of N. fowleri, which can be distinguished based on the length of the internal transcribed spacer 1 and a one bp transition in the 5.8S rDNA. Seven of the eight known types have been detected in Europe. Three types are present in the USA, of which one is unique to this country. Only one of the eight types occurs in Oceania (Australia and New Zealand) and Japan. In mainland Asia (India, China and Thailand) the two most common types are found, which are also present in Europe and the USA. There is strong indication that the pathogenic N. fowleri evolved from the nonpathogenic Naegleria lovaniensis on the American continent. There is no evidence of virulence differences between the types of N. fowleri. Two other Naegleria spp. are pathogenic for mice, but human infections due to these two other Naegleria spp. are not known.     

Specific primers for PCR amplification of the ITS1 (ribosomal DNA) of Trypanosoma lewisi

Trypanosoma lewisi is a mild or non-pathogenic parasite of the sub-genus Herpetosoma transmitted by fleas to rats. In a previous study we described pan-trypanosome specific primers TRYP1 which amplify the ITS1 of ribosomal DNA by hybridizing in highly conserved regions of 18S and 5.8S genes. These primers proved to be useful for detecting T. lewisi DNA in laboratory rats, but a recent large scale survey in wild rodents demonstrated a lack of specificity. In the present study, we designed and evaluated mono-specific primers LEW1S and LEW1R, for the detection and identification of T. lewisi by a single-step PCR. These primers were designed inside the highly variable region of the ITS1 sequence of T. lewisi ribosomal DNA. The product size of 220 bp is specific to T. lewisi. The sensitivity limit was estimated between 0.055 and 0.55 pg of DNA per reaction, equivalent to 1–10 organisms per reaction. All the PCR products obtained from 6 different T. lewisi isolates were more than 98% similar with each other and similar to the sequences of T. lewisi already published in Genbank. All DNA of 7 T. lewisi stocks from China gave the specific 220 bp product. We showed that LEW1S and LEW1R primers enabled sensitive detection and identification of T. lewisi infection in laboratory and wild rats. This assay is recommended for monitoring T. lewisi infections in rat colonies or for studying infections in the wild fauna. An absence of cross reaction with human DNA means that these primers can be used to investigate atypical trypanosome infections in humans. Given the risk of T. lewisi infection in human, we believe that these primers will be beneficial for public health diagnosis and rodents investigation programmes.     

16个产地地乌药材的系统鉴定及质量评价

目的:构建地乌药材基原物种系统鉴定体系,并对全国16个产地的地乌药材进行综合品质评价,为地乌药材产地选择及临床用药安全奠定基础。方法:使用传统鉴别方法结合DNA条形码核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列分子鉴定技术快速鉴别地乌药材真伪,并基于HPLC-UV对地乌药材中5个有效成分进行含量测定,采用Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.01%三氟乙酸溶液(30∶70),检测波长210 nm,柱温30℃,流速1.0 mL·min-1。结果:传统鉴别及DNA条形码快速鉴别技术均能准确鉴别地乌药材真伪。BLAST比对分析发现,16个产地地乌药材均与林荫银莲花Anemone flaccida具有最大相似度;基于多指标成分含量测定表明湖北恩施板桥镇的地乌药材中5个三萜皂苷类成分含量之和最高(10.59%),其次为贵州毕节赫章(6.28%)和湖北长阳都镇湾(5.64%)。结论:DNA条形码技术可作为地乌药材传统鉴定技术的有效补充,该鉴别体系可保障地乌药材基原准确及临床用药安全。HPLC多指标成分综合评价及聚类分析结果表明在本研究所涉及的产地中,湖北恩施、长阳、五峰,贵州毕节和重庆金佛山的地乌药材质量较优,可作为地乌药材的重要产地。     

三七片DNA条形码分子鉴定及方法学考察

目的为研究DNA条形码技术在中成药鉴定中的应用,以三七片为研究对象,对方法的适用性、专属性与精密度进行考察。方法收集15批次市售三七片样品,考察三七片DNA提取条件,并对"中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则"中PCR扩增、序列获得、结果判定等方法适用性进行确认;收集三七、人参、西洋参,制作三七片及其掺伪品,考察方法的专属性和重现性。结果三七片取样量100 mg,56℃水浴8 h所获得DNA的质量浓度平均值为60.7 ng/μL,PCR扩增、序列获得和结果判定均可获成功;三七、人参和西洋参的ITS2序列长度均为230bp,三七与人参、三七与西洋参的序列间均存在7个稳定的SNP位点,自制三七片和掺伪三七片均可成功获得ITS2序列,不同比例三七与人参、三七与西洋参的测序峰图在SNP位点处呈现相应峰高比的SNP套峰具备专属性;重复性、中间精密度和重现性考察符合《中国药典》2015年版(通则9101)相关要求。结论 ITS2序列作为DNA条形码能够稳定、准确鉴定三七片的原料药材,具备良好的专属性和精密度,三七片DNA条形码分子鉴定法将为保障三七片临床用药安全提供新的技术手段,并对《中国药典》其他收载单方制剂的鉴定提供参考。