黄芪与其混伪品的ITS序列分子鉴定研究

目的:研究黄芪与其混伪品之间的DNA分子鉴别方法.方法:采集不同产地的黄芪药材13份,替代品红芪2份,混伪品紫花苜蓿3份和蜀葵1份,所有样品进行总DNA的提取,PCR扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,同时从GenBank下载蓝花棘豆、锦鸡儿2种伪品的ITS序列.用MEGA 4计算其种间的K-2-P距离,最后利用ITS序列构建其系统发育树.结果:测得了19份样品的ITS序列全长,分别为蒙古黄芪646 ～ 650 bp,膜荚黄芪为646～650 bp;红芪为664 bp;紫花苜蓿为659 bp;蜀葵为728 bp,在GenBank中注册,获得登记号.通过以ITS序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将黄芪与其混伪品有效的区分开.结论:ITS序列能够成功鉴定黄芪及其易混伪品,可以作为黄芪与其混伪品的分子鉴定方法.     

维吾尔药材新疆圆柏DNA 条形码鉴定研究

目的：本研究采用形态学与DNA 条形码技术,建立维吾尔药材新疆圆柏Juniperus sabina L.及其混伪品的鉴别方法。方法：随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶片和果实,比较外观差异;采用ITS2 序列对新疆圆柏及其混伪品10 份样品进行PCR 扩增并测序,结合GenBank 获得4 条侧柏ITS2序列,比较14 份样品ITS2 序列种内和种间变异,采用K2P 模型构建NJ 系统树。结果：4 种植物叶片和果实外观相态均有相似之处;DNA 条形码ITS2 序列鉴定结果显示,14 份研究样品ITS2 序列长度均为219 bp,种间最大K2P 距离为0.089。结论：ITS2 序列及NJ 树可将新疆圆柏与3 种混伪品植物区分,为维吾尔药材新疆圆柏的标准化奠定基础。     

沙苑子与其混伪品的ITS序列分子鉴别研究

目的：研究沙苑子与其混伪品之间的 DNA 分子鉴别方法。方法：采集不同产地的沙苑子药材10份,基原植物2份,达乌里黄芪3份,蒙古黄芪4份,直立黄芪3份,混伪品猪屎豆和凹叶野百合各1份,所有样品进行总 DNA 的提取,PCR 扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,用 MEGA 计算其种间的 K-2-P 距离,最后利用 ITS 序列构建其系统发育树。结果：测得了24份样品的 ITS 序列全长,分别为沙苑子644～688 bp,蒙古黄芪为646～673 bp;直立黄芪685～687 bp;达乌里黄芪为676～688 bp;猪屎豆为785 bp;凹叶野百合为837 bp。通过以ITS 序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将沙苑子与其混伪品有效的区分开。用 MEGA 软件基于 ITS 序列构建的沙苑子与其混伪品间的遗传距离分析得到了沙苑子与达乌里黄芪的种间 K-2-P 距离0.0802;蒙古黄芪为0.0812,与直立黄芪之间的遗传距离为0.0824,凹叶野百合和猪屎豆与沙苑子的遗传距离稍大,达到0.2362和0.2299。用 MEGA 软件测定沙苑子种内遗传距离为0.0010。此外,对通过测定种间的遗传距离发现,蒙古黄芪与直立黄芪种间的遗传距离最小为0.0009,与猪屎豆种间的遗传距离最大为0.2362。结论：ITS 序列能够成功鉴定沙苑子及其混伪品,可以作为沙苑子与其混伪品的分子鉴别方法。     

中药材半夏及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的：采用ITS2序列对中药材半夏及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,为规范中药材半夏的市场流通,保障临床用药安全及疗效提供参考依据。方法：对半夏及其混伪品共59份样品,通过DNA提取及聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用邻接（NJ）法构建NJ系统聚类树。采用相似性搜索法、最小距离法、NJ 树法考察ITS2序列的鉴定能力。结果：半夏药材的ITS2序列长度为251 bp,应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定半夏药材及其混伪品;半夏种内最大K2P距离小于半夏与混伪品间的最小K2P距离;NJ树显示半夏药材可与其混伪品明显分开。结论：ITS2序列能准确、稳定鉴定中药材半夏药材及其混伪品。     

基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定

目的：基于内转录间隔区（ITS）序列,运用DNA条形码技术对滇鸡血藤药材及其混伪品进行序列比对分析,根据单核苷酸多态性位点构建滇鸡血藤单倍型数据库,建立快速、准确鉴定滇鸡血藤的分子鉴定方法。方法：以滇鸡血藤及其混伪品为材料,利用DNA提取试剂盒,分别提取滇鸡血藤及其混伪品的总DNA,对ITS序列进行聚合酶链式反应扩增及测序分析,使用DNAMAN软件统计其片段长度及变异位点个数,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算Kimura2-parameter遗传距离,并利用邻接法建立系统发育树进行分析。结果：滇鸡血藤ITS序列片段长度为675 bp,共包括19种单倍型,与其主要混伪品的差异位点为212、223、224 bp,系统发育树显示,ITS序列能够区分滇鸡血藤及其混伪品。结论：ITS条形码可以作为区分鉴定滇鸡血藤及其混伪品的分子条形码,包含19个单倍型的单倍型数据库覆盖了滇鸡血藤全部的单倍型。     

基于ITS2序列及二级结构鉴别维吾尔药材黑加仑及混伪品

目的 建立了基于核基因内部转录间隔区(ITS2)序列及二级结构鉴别维吾尔药材黑加仑及其混伪品(黑加仑葡萄和异果小檗)的方法。方法 对维吾尔药材黑加仑及其混伪品的ITS2序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并双向测序，Codon Code Aligner软件对测序峰图进行序列拼接，用MEGA 6.0软件对拼接后的序列进行多重比对。计算种内、种间遗传距离，构建邻接法(Neighbor-Joining, N-J)系统聚类树，预测其ITS2二级结构。结果 经PCR扩增测序后，黑加仑药材ITS2序列长度均为238 bp, GC含量为57.14%～57.98%,A₁为主体单倍型；黑加仑葡萄药材序列长度均为226 bp, GC含量为47.79%,仅为一个单倍型；异果小檗药材序列长度均为223 bp, GC含量为53.36%,仅为一个单倍型。并且维吾尔药材黑加仑的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。二级结构表明黑加仑及混伪品其螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋角度均有明显差异。结论 ITS2序列可以作为鉴定维吾尔药材黑加仑及其混伪品的DNA条形码，为维吾尔药材黑加仑的用药安全提供...     

基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较

为考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力,该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究。采用MEGA 5.1对获得的ITS2和psbA-trnH进行序列比对,计算种内和种间kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。结果显示,车前和平车前的ITS2 序列长度分别为199,200 bp;两者的ITS2序列种内最大 K2P 遗传距离均小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于ITS2 序列构建的NJ 树中,车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性,都能相互明显区分。表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分。车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp,两者的psbA-trnH 序列种内最大K2P 遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于psbA-trnH 序列构建的NJ 树结果显示,除大车前外,车前子药材与其余混伪品可以明显区分。因此,ITS2序列作为DNA条形码,车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力,对保障车前子用药安全具有重要意义。     

基于ITS2序列鉴定苗药金铁锁及其混伪品

目的：本研究利用ITS2序列对苗药金铁锁及其混伪品进行鉴定研究,从而确保药材质量,保障临床用药安全。方法：提取金铁锁药材及其混伪品基因组DNA,PCR扩增并双向测序获得ITS2序列。所有序列经过CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,采用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。采用相似性搜索法、最近距离法、邻接（NJ）树法对ITS2序列鉴定能力进行评估。结果：金铁锁药材的ITS2序列长度为229 bp,其ITS2序列种内最大K2P遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P遗传距离;应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定金铁锁药材及其混伪品;基于ITS2序列构建NJ树,金铁锁及其混伪品均表现出良好单系性,均能明显区分。结论：ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金铁锁药材及其混伪品,DNA 条形码技术可为金铁锁药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

山茱萸药材及其混伪品的ITS／ITS2序列鉴定研究

利用DNA条形码技术准确快速鉴定山茱萸药材及其混伪品。方法：提取山莱萸及其混伪品的基因组DNA,利用PCR技术扩增它们的ITS序列。所得序列经双向测序后用CodonCode AlignerV3．5．4软件进行拼接和质量评估,用MEGAV5．0计算种内、种间的遗传距离,构建NJ（邻接）树鉴定山茱萸药材及其混伪品。结果：山茱萸药材的ITS序列长度均为659bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为O．005,远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0．357。不同来源的山茱萸药材ITS2序列无变异,长度均为250bp,其与混伪品的种间平均K2P遗传距离为0．571。ITS／ITS2序列的NJ系统聚类树和BLAST比对结果均可明显区分山茱萸药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论：ITS／ITS2序列可准确有效鉴定山茱萸药材,为临床安全用药奠定了基础,也为其它药材的分子鉴定提供了新的思路。     

基于ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品

该研究应用ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品,以期探索牡丹皮药材准确鉴别的新方法。提取牡丹皮及其混伪品的DNA,目标片段经PCR扩增后测序,通过CodonCode Aligner V3.7.1对测序序列进行质量分析和拼接,基于MEGA 5.0中的K2P模型计算牡丹皮与其混伪品的种内、种间遗传距离及构建系统聚类树。牡丹皮ITS2序列长度为227 bp,种内最大K2P距离为0,它与各混伪品的种间最小K2P距离为0.041,种间平均K2P距离为0.222。由NJ树可知：不同产地来源的牡丹皮药材个体聚为一支,自展支持率为99%,呈现出明显的单系性,能很好地与其混伪品芍药、川赤芍、白鲜皮、朱砂根区分开来。应用ITS2序列可以准确鉴别牡丹皮药材及其混伪品,该方法可以作为传统鉴别方法的有效补充。     

基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定

目的:应用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定研究,为中药临床准确用药、市场规范化管理等提供依据和保障。方法:对朱砂根及其混伪品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列、双向测序,对序列进行比对、计算遗传距离。结果:朱砂根ITS2序列长度为217 bp,种内有10个变异位点,有9种单倍型,平均G+C含量为59.1%,除变种红凉伞外,朱砂根与其各混伪品的种间最小遗传距离均大于朱砂根种内最大遗传距离,所以利用ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品。结论 :实验结果表明ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品,但对于其与变种的关系需进一步研究。     

基于ITS2序列鉴定中药材升麻及其混伪品

该研究选用ITS2序列对升麻及其混伪品进行分子鉴定,从而确保用药安全。实验采用DNA条形码技术,对升麻及其混伪品的ITS2核基因片段进行扩增并双向测序,经CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,利用MEGA 5.0软件对相关数据分析,构建邻接（NJ）系统聚类树进行鉴定分析。结果表明升麻药材的3个基原物种：大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia、升麻C. foetida、兴安升麻C. dahurica,其ITS2序列长度分别为217,219,219 bp,3个基原物种ITS2序列与混伪品的种间平均K2P距离大于其种内平均K2P距离,ITS2系统发育树显示,升麻的3个基原物种均各自聚为一单系分支,并与其他混伪品明显分开。ITS2序列能够有效准确地鉴别中药材升麻及其混伪品。     

基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品

为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》,PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明:前胡药材的ITS2序列长度为229~230 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp,种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044,0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此,ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。     

白芷药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定

目的:应用ITS2序列对白芷、杭白芷及其混伪品进行鉴定研究,为白芷药材的准确鉴定提供依据。方法:提取样品总DNA,扩增ITS2序列并双向测序,计算种间、种内Kimura-2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统邻接(NJ)树。结果:白芷的ITS2序列长度为227 bp,平均GC含量为55. 05%,种内最大K2P遗传距离为0. 009 2;杭白芷ITS2序列长度均为227 bp,GC含量为55. 07%,种内无变异位点。白芷与杭白芷种内最大遗传距离均远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离。NJ树结果显示白芷与杭白芷聚为一支,可与其他混伪品明显区分开。结论:ITS2序列能有效地鉴定白芷药材及其混伪品,为白芷药材市场流通管理及临床用药安全提供了新的技术手段,也为其他中药材及其混伪品的鉴定提供参考。     

鸦胆子药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定研究

目的:通过分析鸦胆子及其混伪品的ITS2序列,探究鉴定鸦胆子药材及其混伪品的新方法。方法:采用改良的CTAB法提取鸦胆子及其混伪品的基因组DNA,PCR扩增ITS2片段。对其进行双向测序,应用MEGA6.0软件进行序列分析,计算种内、种间遗传距离,构建邻接树。结果:鸦胆子药材ITS2序列长度为230 bp,种内最大K2P遗传距离为0.018,小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0.493。NJ树结果表明鸦胆子序列和柔毛鸦胆子序列聚为一支,与其他混伪品可明显区分。鸦胆子与柔毛鸦胆子在35位点处有一变异位点,利用此位点能将鸦胆子与柔毛鸦胆子区别开来。结论:ITS2可作为鸦胆子药材及其混伪品鉴定的DNA条形码序列,为保障临床用药安全提供了新的技术手段。     

基于ITS2序列的海桐皮及其混伪品DNA分子鉴定

目的应用ITS2条形码技术,对海桐皮ErythrinaeCortex及其混伪品进行分子鉴定。方法通过提取31份海桐皮药材基原植物刺桐E.variegata、乔木刺桐E.arborescens及其混伪品的基因组DNA,扩增ITS2序列并测序;同时从GenBank下载混伪品序列15种38条,运用MEGA7.0软件进行序列比对,进行种间序列差异分析比较,并构建Neighbor-jioning(NJ)系统进化树,预测ITS2二级结构。结果在海桐皮2种基原中,刺桐的ITS2序列长度为232bp,乔木刺桐的ITS2序列长度为230bp,均为单倍型,可以明显区分;同时与其他刺桐属及易混品之间遗传距离较远。NJ树结果显示刺桐、乔木刺桐及其他易混品均单独聚为一支,表现出良好的单系性;依据ITS2二级结构,刺桐、乔木刺桐及其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异,可以直观地将刺桐与乔木刺桐,以及其与易混品进行区分。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别海桐皮药材,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

基于ITS2序列及二级结构的维吾尔族药材孜然及其混伪品鉴别

目的 应用DNA条形码技术,建立维吾尔族药材孜然及其混伪品小茴香、芫荽子的分子鉴别方法。方法 提取38批孜然及其混伪品的基因组总DNA,聚合酶链式反应（PCR）扩增内转录间隔区2（ITS2）序列并双向测序,测序结果经CodonCode Aligner软件进行序列拼接,利用MEGA软件分析序列特征,计算种内、属间遗传距离,构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树,预测其ITS2二级结构。结果 孜然药材ITS2序列中主体单倍型为A₁,序列长度均为226 bp,鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比为47.79%~48.23%;小茴香ITS2序列中,主体单倍型为B₁,序列长度均为224~227 bp,G+C占比为53.30%~55.36%;芫荽子ITS2序列中,主体单倍型为C₁,序列长度均为220~227 bp,G+C占比为56.82%~56.83%。孜然的种内遗传距离明显小于属间遗传距离。二级结构表明,孜然及其混伪品螺旋区的茎环大小、数目、位置及螺旋角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别孜然及其混伪品药材,为保障孜然临床安全用药提供了有效技术手段。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

市售中药材冬葵子和苘麻子ITS2条形码鉴定

目的利用ITS2条形码序列对市售中药材冬葵子、苘麻子进行分子鉴定,以保证药材使用的正确性和临床药效。方法收集冬葵子、苘麻子及其3种混伪品样品共87份。对实验样品进行ITS2基因片段扩增并双向测序,利用HMMer注释方法获得ITS2序列,再经Codon Code Aligner 6.0.2拼接,使用MEGA6.0进行种内、种间变异分析,遗传距离计算并构建NJ系统发育树;将所得序列转换成二维码图片,扫描识读后通过中药材DNA条形码数据库进行验证。结果冬葵子和苘麻子外观形态相似;冬葵子ITS2序列长度232 bp;GC量为67.6%;苘麻子ITS2序列长度231 bp,GC量为54.1%,二者均无种内变异。冬葵子和苘麻子ITS2序列比对后长度为233 bp,共存在50个变异位点。鉴定结果显示,收集的56份冬葵子药材中26份均为苘麻子,剩余30份为正品。冬葵子和苘麻子与其他3个混伪品的K2P遗传距离为0.224~0.868,平均距离为0.630,种间遗传距离远大于种内遗传距离。基于ITS2序列构建系统发育树可见冬葵子、苘麻子及其3个混伪品各自单独聚成一支,ITS2序列能够明显将其区分;此外,使用二维DNA条形码扫描可准确验证5个物种。结论 ITS2序列能够成功鉴定冬葵子、苘麻子及其常见混伪品,为种子类药材鉴别提供了新工具;二维码技术与DNA条形码技术的结合可以为药材的基原物种提供准确唯一的二维DNA条形码信息,可更好实现药材市场的信息化监管。     

种子类药材补骨脂及其混伪品的ITS2条形码序列鉴定

目的:种子类药材补骨脂具有肝肾毒性,其混伪品曼陀罗子、天仙子、洋金花的种子、猪屎豆也含有毒性成分,且补骨脂与其混伪品外形相似,易导致混用误用,严重危害人体健康。本研究利用DNA条形码技术,分析补骨脂及其混伪品的ITS2序列,以期快速准确鉴定补骨脂及其混伪品,保证其用药安全及临床疗效。方法:对补骨脂及其混伪品样品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列,并进行双向测序,所有序列用MEGA6.0软件进行种间、种内Kimura2-parameter(K2P)遗传距离计算,并构建NJ系统聚类树。结果:补骨脂ITS2序列长度为233bp,G+C含量为69.5%,种内无变异位点。补骨脂与其混伪品种间变异位点较多,种间K2P最小距离为0.5321,远远大于其种内距离,NJ树显示可以将补骨脂及其混伪品完全分开。结论:ITS2条形码序列可准确鉴别种子类药材补骨脂及其混伪品,为保证补骨脂的临床用药安全和种质资源鉴定提供了良好的技术手段。