萱草花药材DNA条形码鉴别与HPLC指纹图谱研究

目的:利用DNA条形码技术对萱草花药材进行物种鉴定,建立其指纹图谱,为萱草花质量控制和鉴定提供依据。方法:提取14批样品的DNA进行序列分析和物种鉴定,并建立高效液相色谱法指纹图谱,采用Waters HSS T3型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.2%乙酸为流动相,梯度洗脱,流速为1 mL·min^(–1),检测波长为360 nm,柱温为35℃。结果:经DNA条形码鉴定,14批萱草花基原均为黄花菜Hemerocallis citrina Baroni。结合指纹图谱共标定了14个共有峰。结论:DNA条形码和指纹图谱2种方法可对萱草花进行物种鉴定,并能全面反映萱草花药材中的成分信息,可用于萱草花药材的真伪鉴定和批间一致性评价。     

DNA条形码鉴定与功效组分测定在紫草质量评价中的应用

目的:利用DNA条形码技术对中药紫草进行基源鉴定,并建立紫草的功效多组分含量测定方法,为全面评价紫草药材质量提供依据。方法:对不同产地紫草进行DNA条形码基原鉴定;采用高效液相色谱法测定紫草中萘醌类成分与含量,Thermo BDS Hypersil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相0.2%冰乙酸-乙腈梯度洗脱,流速0.8 m L·min~(-1),检测波长275 nm,柱温35℃。结果:经DNA条形码鉴定了11批药材,均为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma的干燥根;测定了11批新疆紫草的8种萘醌类功效组分含量,各组分均显示良好分离;不同成分在线性范围内线性关系良好,平均回收率在95.26%~101.40%,RSD均在0.7%~1.8%(n=6)。结论:DNA条形码鉴定确保了新疆紫草药材基源的准确性,组分含量测定方法准确可靠、重复性好,二者结合可作为紫草的质量控制方法。     

HPLC含量测定和DNA分子标记技术对不同产地金银花的鉴定

目的:通过指标成分含量测定及DNA分子标记技术对不同产地金银花样品进行鉴定,探讨DNA分子鉴定技术在中草药鉴别领域的应用前景。方法:以绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙为指标成分,利用HPLC测定指标成分含量。提取金银花、山银花对照药材及河北和山东产地金银花样品DNA,检测DNA浓度和纯度,采用基于聚合酶链式反应(PCR)方法的DNA分子标记技术鉴别样品。结果:河北和山东产地金银花中绿原酸质量分数3.1%~3.3%,河北、山东产地金银花中木犀草苷质量分数分别为0.049%~0.050%,0.069%~0.078%,2个产地样品中均未检出灰毡毛忍冬皂苷乙成分。采用基于PCR方法鉴定出河北和山东产地各3批样品均为金银花。结论:DNA分子鉴定技术作为含量测定常规方法的补充,具有准确可靠、重复性高等优点,可用于金银花药材的鉴定。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

基于DNA条形码对湖北中药材市场的调查分析

目的：湖北省中药历史悠久,是我国重要的药材主产区之一,调查分析湖北市场流通中药材真伪情况对市场监管具有重要意义。方法：本文利用DNA条形码鉴定技术对抽样于湖北中药材市场的12份动物药及494份植物药提取总DNA并扩增相应鉴定序列,比对标准数据库实现真伪鉴别。结果：针对所抽样品,获得鉴定序列COI 12条,ITS2 482条,扩增成功率为98%;477份样品准确鉴定到种,鉴定成功率97%;共鉴定出伪品28份,占所抽查样品的5.5%,其中皂角刺掺伪9%,川贝母掺伪20%,桃仁掺伪44%。结论：DNA条形码技术作为一种快速、准确、易标准化的鉴定方法,为保障中药材用药安全提供有力技术手段,将在中药材市场监管中发挥重要技术支撑作用。     

基于ITS2、trnH-psbA条形码的不同产地连翘及其伪品DNA分子鉴定

目的:研究探讨基于ITS2、trnH-psbA条形码的不同产地连翘及其伪品DNA分子鉴定新技术。方法:采用植物DNA条形码候选序列中的ITS2、trnH-psbA作为目标条形码,探讨了其对不同产地连翘、正品连翘与其易混伪品金钟花的鉴别。结果:从聚类树形图可见,连翘与金钟花能够明显地分为两支,不同产地的连翘也表现出了一定的区域相似性。结论:基于ITS2序列、trnH-psbA序列可以作为连翘药材真伪鉴别的一种有效的分子鉴定手段。其中trnH-psbA序列构建的NJ树、UP树不仅能实现连翘真伪鉴别,而且可以用于不同产地连翘区域性的鉴别。     

改进的CTAB法提取32种中药破壁饮片DNA及物种鉴定

中药破壁饮片是由传统中药饮片经过气流破壁技术加工而成,已失去了原药材原有的外观性状特征,传统的鉴别方法已很难鉴别其真伪。本研究选用ITS2序列作为DNA条形码对32个中药破壁饮片品种进行研究,验证DNA条形码技术应用于中药破壁饮片上的可行性。通过提取32个品种的DNA、PCR扩增及双向测序获得ITS2序列,在中药材DNA条形码鉴定系统和NCBI数据库中进行比对。实验结果表明:32个品种通过改良的CTAB法均能成功提取DNA,PCR扩增及测序后均能得到高质量的ITS2序列。因此,基于ITS2序列的DNA条形码技术可有效地鉴定中药破壁饮片,为中药破壁饮片真伪鉴别提供有效手段。     

脱氧核糖核酸条形码在蛤蚧真伪品鉴定中的前景

蛤蚧作为重要的动物药材,在咳嗽、哮喘、胆结石及性功能障碍上有治疗功效.由于药材蛤蚧原动物大壁虎(Gekko gecko)物种数量逐年减少,不能满足中药市场的需求而出现了众多伪品.文章概述了近二十年来蛤蚧及其伪品的鉴别研究情况,介绍了传统性状、显微、理化和现代分子生物学技术等鉴定方法,并比较总结了各种方法在蛤蚧真伪品鉴定中的特点.在此基础上,引入物种识别学科前沿-DNA条形码(DNA Barcoding)技术,并阐述了其在蛤蚧真伪品鉴定中的优势和应用前景.     

应用DNA条形码技术对市场苦木药材的检测研究

利用DNA条形码技术对市场上中药材苦木进行检测,为其市场监管及用药安全提供保障。方法：对15份苦木药材（每份取样2个）共30个样品进行DNA提取,PCR扩增其ITS2序列并双向测序,应用CodonCode Aligner version 6.0.2软件对测序峰图进行校对拼接,将得到的所有序列与GenBank以及中药材DNA条形码鉴定系统分别进行比对,选择相似度最相近的物种在中国植物志网站上查询。在此基础上扩增其psbA-trnH 序列以验证结果的可靠性。结果：市场购买的苦木样品中正品苦木Picrasma quassioides 占70%、臭椿Ailanthus altissima占6.67%、板蓝Baphicacanthus cusia占13.33%、楝叶吴茱萸Tetradium glabrifolium占3.33%、柘Maclura tricuspidata 占6.67%。结论：市场上苦木药材存在混伪品,DNA条形码技术能有效鉴别药材真伪。     

基于ITS2序列的维吾尔药材神香草鉴定研究

目的:采用DNA条形码技术建立维吾尔药材神香草鉴别的方法。方法:使用DNA条形码ITS2序列,建立了维吾尔药材神香草基原植物DNA条形码ITS2序列标准数据库,对市售11份"神香草"药材进行鉴定。结果:市售神香草药材仅有2份为维吾尔药材标准中收录的硬尖神香草,1份为神香草属植物,1份为鼠尾草属植物,其余7份来源于荆芥属植物。结论:DNA条形码ITS2序列可作为鉴定维吾尔药材神香草及其伪品药材的有效工具。     

Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2

Aim of the study

To test whether the ITS2 region is an effective marker for use in authenticating of the family Fabaceae which contains many important medicinal plants.

Materials and methods

The ITS2 regions of 114 samples in Fabaceae were amplified. Sequence assembly was assembled by CodonCode Aligner V3.0. In combination with sequences from public database, the sequences were aligned by Clustal W, and genetic distances were computed using MEGA V4.0. The intra- vs. inter-specific variations were assessed by six metrics, wilcoxon two-sample tests and “barcoding gaps”. Species identification was accomplished using TaxonGAP V2.4, BLAST1 and the nearest distance method.

Results

ITS2 sequences had considerable variation at the genus and species level. The intra-specific divergence ranged from 0% to 14.4%, with an average of 1.7%, and the inter-specific divergence ranged from 0% to 63.0%, with an average of 8.6%. Twenty-four species found in the Chinese Pharmacopoeia, along with another 66 species including their adulterants, were successfully identified based on ITS2 sequences. In addition, ITS2 worked well, with over 80.0% of species and 100% of genera being correctly differentiated for the 1507 sequences derived from 1126 species belonging to 196 genera.

Conclusions

Our findings support the notion that ITS2 can be used as an efficient and powerful marker and a potential barcode to distinguish various species in Fabaceae.     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。     

中药材黄芪的DNA指纹图谱鉴别

为鉴别中药材黄芪的品种及其代用品,采用高盐低pH值法提取药材的基因组DNA,利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术扩增药材基因组DNA样品。结果表明,高盐低pH值法较适用于黄芪类药材基因组DNA的提取,其中2个引物可作为高特异性引物,根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异准确鉴别黄芪和红芪。RAPD方法可以准确、快速地鉴定黄芪及其代用品。     

中药材黄芪的DNA指纹图谱鉴别

为鉴别中药材黄芪的品种及其代用品，采用高盐低pH值法提取药材的基因组DNA，利用随机扩增多态DNA（RAPD）技术扩增药材基因组DNA样品。结果表明，高盐低pH值法较适用于黄芪类药材基因组DNA的提取，其中2个引物可作为高特异性引物，根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异准确鉴别黄芪和红芪。RAPD方法可以准确、快速地鉴定黄芪及其代用品。     

六类十八种中药对血栓素A2和前列环素合成的影响

本实验应用猪肺微粒体为供酶体,与花生四烯酸为底物进行反应,生成血栓素A_2(TXA_2)和前列环素(PGI_2)的方法,对6类18种中药进行实验研究。结果发现北沙参是一味对花生四烯酸代谢具有双向调节作用的药物;生大黄300mg组和灯盏花仅对TXA_2合成有明显抑制作用,对前列环素合成无明显影响;党参、黄芪、当归、人参皂甙、黄芩素等在一定剂量范围内主要抑制TXA_2合成,而对前列环素合成影响很小。这表明传统中药中存在着多种具有抑制TXA_2生成的中药,这些药物丰富了活血化瘀药的内容;而传统活血化瘀药在显著抑制TXA_2生成中仍占有重要地位。某些具有补益作用的中药具有不同程度的既抑制TXA_2合成,又促进或不抑制PGI_2合成的特点。这种扶正祛邪或祛邪不伤正的作用特点明显优于已知对照药阿司匹林和一些活血化瘀药。     

复方银黄微型灌肠剂对发热大鼠下丘脑前列腺素E2含量的影响

目的观察复方银黄微型灌肠剂(YHCE)的解热作用及对发热大鼠下丘脑中前列腺素E2(PGE2)含量的影响,初步探索其解热机制。方法采用皮下注射20%酵母混悬液(10 ml/kg)造大鼠发热模型,1h后灌肠给药,分别于给药后2,4,6h观测肛温,用ELISA法测定大鼠下丘脑中PGE2含量。结果YHCE能在给药后2,4,6 h显著抑制大鼠体温上升(P<0.01),并在给药后2,4 h明显抑制PGE2含量的增高(P<0.05)。结论复方银黄微型灌肠剂有解热作用,而且能降低发热大鼠下丘脑的PGE2含量。     

调脂新对高脂血症大鼠一氧化碳／内皮素、6—keto—PGF1a／TXB2及血液流变学的影响

目的：研究了调脂新（TZX）对高脂大鼠一氧化氮／内皮素、6-keto-PGF1a／血栓烷及血液流变学的影响。方法：用高脂乳剂喂饲40d以形成大鼠高脂血症及动脉粥样硬化模型,同时给药组ig调脂新40、80g/kg,测定血中NO、ET－16-keto-PGF1、TXB2及血液流变学各指标。结果：调脂新对正常及高脂大鼠血清NO水平有一定升高,明显降低ET－1水平,大剂量能显著升高6-keto-PGF1a含量,有利于维持6-keto-PGF1a/TXB2平衡;可降低全血比粘度、全血还原比粘度、血浆比粘度,降低RBC聚集指数、压积,缩短RBC电泳时间,并能降低纤维蛋白原含量,对ADP诱导的正常大鼠血小板聚集,亦有一定的抑制作用。结论：调脂新改善高脂大鼠血液流变学异常、恢复NO／ET、6-keto-PGF1a/TXB2平衡,可能是其抗动粥作用的机制之一。     

川芎嗪抗伤害性反应作用机制初探

目的　观察川芎嗪(TMP)对嘌呤2 X(P2 X)受体激动剂[三磷酸腺苷(ATP)和α,β-亚甲三磷酸腺苷(α,β- me ATP) ]、前列腺素E2 (PGE2 )及P物质(SP)所致大鼠足底急性伤害性反应的影响。方法　通过大鼠痛行为反应确定局部应用TMP对ATP等P2 X受体激动剂、PGE2 及SP所致大鼠足底急性伤害性反应和足底炎症水肿的影响。结果　TMP (10 mm ol/L )明显抑制ATP (1μm ol/L )或α,β- m e ATP (0 .6μm ol/L )引起的大鼠足底急性伤害性反应。TMP(10 m mol/L)可抑制PGE2 (5 μmol/L)或α,β- me ATP(0 .2 μm ol/L)加PGE2 (5 μmol/L )引起的伤害性反应。TMP (10 m mol/L )不影响α,β- me ATP (0 .2μmol/L )加SP (10μmol/L )引起的伤害性反应。TMP对PGE2 、SP或α,β- m e ATP分别加PGE2 或SP引起的大鼠足底炎症水肿无明显影响。结论　TMP主要通过抑制P2 X受体兴奋介导的伤害性信息传递产生抗伤害性反应作用。     

仙芦抗癌胶囊抗肿瘤作用及对肝癌HepG2细胞内Ca2+浓度的影响

目的观察仙芦抗癌胶囊的体内外抗肿瘤作用及对人肝癌HepG2细胞内Ca2 浓度([Ca2 ]i)的影响,从而揭示仙芦抗癌胶囊的抗肿瘤作用机制。方法通过观察仙芦抗癌胶囊对S180A荷瘤小鼠瘤质量和H22小鼠生存时间的影响,观察其体内抗肿瘤作用。通过MTT法观察含药血清对肝癌HepG2细胞的细胞毒作用。通过Fluo-3/AM标记HepG2肝癌细胞,激光共聚焦扫描显微术测定肿瘤细胞[Ca2 ]i,ATP酶试剂盒测定HepG2细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性。结果仙芦抗癌胶囊(1.00、0.50、0.25g/kg)对S180A小鼠的瘤体生长有显著的抑制作用,对H22小鼠的生存时间有显著的延长作用。仙芦抗癌胶囊体外对HepG2细胞有细胞毒作用;对细胞[Ca2 ]i有显著升高作用,高、中剂量(1.00、0.50g/kg)能够降低HepG2肝癌细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性。结论仙芦抗癌胶囊有明显的体内外抗肿瘤作用,其作用机制为抑制肿瘤细胞膜Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性,增加细胞[Ca2 ]i,从而诱导肿瘤细胞凋亡,达到抗肿瘤作用的目的。     

复方莪术散对子宫内膜异位症大鼠异位内膜组织基质金属蛋白酶2和血管内皮生长因子表达的影响

目的研究复方莪术散治疗子宫内膜异位症(EM)的作用机制。方法 Wistar大鼠60只,采用自体移植法建立EM大鼠模型,将造模成功的40只大鼠随机分为复方莪术散低、中、高剂量组[分别以5.85g/(kg·d),11.7g/(kg·d),23.4g/(kg·d)],孕三烯酮组[0.05mg/(kg·d)],模型对照组(生理盐水1ml/100g),选取8只作为空白对照组(生理盐水1ml/100g),各组连续灌胃28d,每天1次。28d后测定大鼠在位以及异位子宫内膜组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果 EM大鼠异位子宫内膜组织中MMP-2和VEGF蛋白表达高于在位子宫内膜组织(P<0.05);复方莪术散在一定剂量关系上能显著抑制异位组织的生长,缩小异位病灶体积,抑制MMP-2和VEGF的表达,与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方莪术散可抑制MMP-2和VEGF表达水平,降低异位病灶的侵袭和血管生成能力,这可能是其治疗EM的机制之一。