WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响

目的研究WIP1基因对小鼠骨髓B细胞发育及胸腺T细胞发育的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞发育中各阶段的细胞比例。结果虽然WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育各阶段比例正常,但骨髓总体B细胞比例下降;WIP1基因敲除小鼠胸腺发育障碍,CD8/CD4双阴性细胞比例增高,CD8/CD4双阳性细胞比例降低。结论 WIP1基因在小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞的发育过程中起重要作用。     

载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及病理组织学观察

目的观察载脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠血脂及病理组织学变化。方法选择24只ApoE-/-基因敲除小鼠,雌雄各半,另选同龄的雌雄各半C57BL/6J小鼠24只为对照,观察小鼠血脂及心脏病理形态学变化。结果 ApoE-/-基因敲除小鼠组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与对照组相比无差异（P〉0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组动脉粥样硬化斑块大小较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠心肌发生粥样硬化病变改变。结论 ApoE-/-基因敲除小鼠更容易引起动脉粥样硬化病灶形成。     

Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的表达

目的 建立Pax-8基因敲除模型及Pax -8基因的体外干扰实验,探索心肌细胞中Pax-8基因抑制后解偶联蛋白2(uncouplingprotein 2,UCP2)基因表达的变化.方法 Pax-8基因敲除纯合子小鼠(Pax-8 KO-/-)为实验组,Pax-8基因敲除小鼠杂合子(Pax -8 KO+/-)和野生型(Pax-8KO+/+)为对照组;同时在体外实验的大鼠心肌细胞株中,加入Pax -8基因的小干扰RNA(Pax-8siRNA)为实验组,非特异性siRNA(NC siRNA)组和空白组为对照组.采用RT-PCR和Westernblotting技术测定UCP2的mRNA和蛋白质表达.结果 在Pax-8基因敲除动物模型中,与Pax-8基因敲除小鼠杂合子组和野生型组相比,实验组Pax-8基因敲除小鼠纯合子心脏组织UCP2的mRNA和蛋白表达均上调( P<0.05),而对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);在体外干扰实验中的结果显示,与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组UCP2的mRNA表达和蛋白表达均上调(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 Pax-8基因被抑制后,心肌细胞凋亡增加,UCP2基因表达上调,提示UCP2参与了心肌细胞凋亡的调控.     

应用活体荧光技术观察LDLR-/-小鼠血管损伤后初期病变形成的动态变化

目的应用活体荧光技术,研究血管损伤后初期病变形成的动态变化。方法112只雄性LDLR-/-小鼠随机分成14组,每组8只。将绿色荧光蛋白表达而低密度脂蛋白受体敲除(GFP⁺/ LDLR-/-)小鼠的骨髓移植到LDLR-/-小鼠中,行血管损伤手术。从术后第1天至14天,麻醉小鼠,在荧光显微镜下直接观察股动脉血管病变变化的动态状况。结果术后第1天即见血管内大量荧光细胞随血液高速循环,术后第3天出现血液中的荧光细胞呈点状粘附于血管内壁,术后第6天,在血管内壁荧光细胞粘附的部位,外膜组织开始明显增生,增生的外膜组织中可见荧光细胞,此时血管内壁的病变呈不规则的片状分布。术后第9天,血管外纤维组织显著增生,并见大量的荧光细胞,同时可见外膜组织中有血液流动的新生营养血管。至病变第14天,受损血管的病变程度在以前的基础上继续增加,病变部位血管内膜上粘附聚集大量的荧光细胞,形成内衬而附着于血管内膜。结论血管损伤后的初期病变存在着由血管内到外的发展趋势。病变的形成与循环血中骨髓来源的干细胞在内膜部位粘附和聚集具有紧密的联系,血管内膜的病变对血管外纤维组织的增生具有明显的影响。     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.     

甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因功能的初步研究

目的 利用λRed重组系统敲除甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因构建突变株,并且制备相应的回复株,进而初步研究该基因的功能.方法 PCR扩增得到上、下游同源臂,与卡那霉素抗性基因片段共同构建打靶片段,将其浓缩后转化含λRed重组系统的甲型副伤寒沙门氏菌(50973株),经PCR鉴定后得到突变株;将重组酶表达质粒pACU184与ompW基因的调控区和编码区序列连接后电转入突变株中,双酶切鉴定得到相应的回复株;SDS-PAGE及Western blot鉴定野生株、突变株与回复株中OmpW蛋白的表达情况;生化鉴定野生株、突变株与回复株,并观察野生株与突变株生长曲线的差异;测定野生株、突变株与回复株活菌半数致死量( LD50),以此来观察ompW基因与细菌毒力的相关性.结果 在甲型副伤寒沙门氏菌50973株中成功敲除了ompW基因,并构建了相应回复株;野生株与回复株均可表达出OmpW蛋白,突变株没有出现该蛋白的表达;野生株、突变株与回复株生化鉴定结果均为甲型副伤寒沙门氏菌,且野生株和突变株生长无明显差异;三者LD50均不存在显著差异.结论 甲型副伤寒沙门氏菌的ompW基因与该菌致病毒力无相关性,但突变株的构建为后续研究该基因具体功能提供了基础.     

肝脏特异性Nampt基因敲除对缺血性脑卒中的影响

目的 烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是缺血性脑卒中的治疗新靶点.本研究旨在阐明肝脏来源的Nampt是否对缺血性脑卒中具有保护作用.方法 运用Cre/loxP系统制备肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠.将NamptloxP/loxP小鼠与肝脏...     

补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响

目的:观察补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响。方法:81只补体C3基因敲除小鼠随机分三组(n=27):A组:假手术组;B组:慢性坐骨神经结扎模型(CCI)组;C组:CCI模型补体C3干预组。测定小鼠的热痛阈值和机械痛阈值,并取腰5、6脊髓节段测定GFAP mRNA和GFAP表达。结果 :术前三个组小鼠热和机械痛阈无明显差异,术后1天A组热和机械痛阈下降,其后恢复。B组和C组继续下降,C组下降幅度更大(P<0.05)。术后第1天,B组和C组胶质细胞激活轻微,术后第3、7天B组和C组脊髓组织GFAP mRNA和GFAP表达量逐渐增加,且C组其表达量明显高于B组。结论 :补体C3的存在与神经病理性模型小鼠星形胶质细胞激活显著相关,并由此影响到慢性疼痛状态的出现和维持。     

Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定

本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。     

人大肠癌细胞系HCT116中Sirt 1基因敲除细胞株的构建

目的利用AAV介导的体细胞基因敲除技术,在人大肠癌细胞系HCT116中对靶基因Sirt 1进行敲除,达到基因沉默的目的。方法构建Sirt1打靶载体,通过病毒包装、感染、药物筛选、PCR鉴定、Western blotting鉴定等步骤获得Sirt 1基因敲除的细胞株。结果经过筛选和鉴定后获得两个Sirt1-/-阳性克隆,成功构建HCT116 Sirt1-/-细胞系。结论通过体细胞敲除技术,我们成功地获得Sirt1敲除肠癌细胞株。