结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建与鉴定

结核分枝杆菌感染人体后主要寄生在宿主巨噬细胞内,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白( small heat shock proteins,sHSPs) Hsp16.3是其在宿主巨噬细胞内生存繁殖所必需的蛋白质,已有研究表明Hsp16.3与结核分枝杆菌的潜伏感染关系密切,本研究利用基因敲除技术构建了结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因打靶载体,为进一步敲除结核分枝杆菌Hsp16.3基因( hspX,Rv2031C),并为研究Hsp16.3基因的功能及探讨结核病的防治提供可行的研究方法.     

结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株的构建与鉴定

目的 构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。方法 体外培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株,并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列,分别插入到pKO质粒载体预定位点中,构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株内,并与其基因组中的Hsp16.3基因同源交换,筛选出Hsp16.3基因缺失突变株。结果 通过卡那霉素筛选和蔗糖反筛选及PCR鉴定,并在含有潮霉素培养基上不能生长的菌株为Hsp16.3基因缺失突变株。结论 成功构建出结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。     

不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠对肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化的影响

目的:探讨不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化。方法:不同毒力结核分枝杆菌悬液分别经小鼠尾静脉注射、复制及鉴定各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型复制成功后第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取感染小鼠肺泡巨噬细胞,以激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测上述各时间点、各组感染小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率,比较各组感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。结果:激光共聚焦显微镜检测结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染小鼠模型组和卡介苗菌株(BCG)感染小鼠模型组,在小鼠感染模型复制成功后1～9天,小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率逐渐升高,9天时两组小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率均达最高,随着时间的延长,两组小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率呈现逐渐降低趋势。结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染小鼠组,感染小鼠的肺泡巨噬细胞的凋亡率明显高于卡介苗菌株(BCG)感染小鼠组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:感染小鼠的肺泡巨噬细胞的凋亡率与结核分枝杆菌的毒力强弱呈正相关。     

基因敲除技术在结核病研究中的应用

1989年,美国科学家Capecchi[1]通过研究胚胎干细胞同源重组原理获得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capec-chi与美国科学家Smithies、英国科学家Evans共同分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,成为基因敲除研究史上的又一里程碑。经过20多年的不断发展,     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.