应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDDl的研究

目的应用改良的体细胞基因敲入技术将标签序列靶向敲人目的基因。方法设计引物并构建RHBDDI的打靶载体,经过腺相关病毒包装、感染、新霉素筛选和鉴定等步骤获得含有新霉素抗性的阳性单克隆细胞株,最后通过ere病毒感染和筛选获得RHBDDI内源敲人FLAG和SBP双标签的HCTI16结直肠癌细胞株。结果经过包装病毒感染与筛选验证后得到6个打靶阳性克隆;进一步经ere病毒感染与筛选后得到2株去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆;通过Western blotting实验证明RHBDDl-FLAG-SBP融合蛋白的表达。结论通过改良的体细胞基因敲入技术成功构建跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDDl内源敲入FLAG和SBP双标签的HCTll6结直肠癌细胞株。     

非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白C'末端SBP-3×Flag标记的HCT 116结直肠癌细胞模型的建立

目的建立非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)C'末端SBP-3×Flag标记的HCT116结直肠癌细胞模型。方法 PCR扩增同源臂,构建TPX2的腺相关病毒打靶载体,包装病毒后打靶HCT116结直肠癌细胞,G418和PCR筛选获得含有新霉素抗性基因的阳性细胞株,最后通过Cre病毒感染去除抗性基因,并用PCR方法筛选获得TPX2C末端SBP和3×Flag内源性双标签的HCT116结直肠癌细胞株。结果筛选获得2个含有新霉素抗性基因的细胞株,随后经Cre病毒感染得到去除新霉素抗性基因的阳性细胞克隆,并经Western blot检测验证了SBP-3×Flag基因的敲入。结论成功建立了TPX2 C'末端SBP-3×Flag标记的HCT116结直肠癌细胞模型。     

应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1的研究

目的应用改良的体细胞基因敲入技术将标签序列靶向敲入目的基因。方法设计引物并构建RHBDD1的打靶载体,经过腺相关病毒包装、感染、新霉素筛选和鉴定等步骤获得含有新霉素抗性的阳性单克隆细胞株,最后通过cre病毒感染和筛选获得RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。结果经过包装病毒感染与筛选验证后得到6个打靶阳性克隆;进一步经cre病毒感染与筛选后得到2株去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆;通过Western blotting实验证明RHBDD1-FLAG-SBP融合蛋白的表达。结论通过改良的体细胞基因敲入技术成功构建跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。     

Keap1-NRF2在癌症中的激活与失调机制

Keap1-NRF2系统是细胞针对活性氧(ROS)和亲电基团所引起的内外源性应激反应的重要调节机制。虽然转录因子NRF2的短暂激活阻止了正常组织和癌前组织中癌症的发生发展,但在恶性肿瘤细胞中NRF2的持续激活通过增加肿瘤治疗耐药性和促进肿瘤细胞生长从而对宿主产生有害影响。本综述对Keap1-NRF2在癌症中的激活与失调机制进行总结并探索其在癌症基因治疗中的应用。     

人大肠癌细胞系HCT116中Sirt 1基因敲除细胞株的构建

目的利用AAV介导的体细胞基因敲除技术,在人大肠癌细胞系HCT116中对靶基因Sirt 1进行敲除,达到基因沉默的目的。方法构建Sirt1打靶载体,通过病毒包装、感染、药物筛选、PCR鉴定、Western blotting鉴定等步骤获得Sirt 1基因敲除的细胞株。结果经过筛选和鉴定后获得两个Sirt1-/-阳性克隆,成功构建HCT116 Sirt1-/-细胞系。结论通过体细胞敲除技术,我们成功地获得Sirt1敲除肠癌细胞株。     

人源抗人类免疫缺陷病毒1型基因工程抗体的初步研究

目的 构建噬菌体抗体库,筛选抗HIV-1抗体Fab,并对其进行鉴定.方法 采集无症状、HIV-1抗体滴度较高的HIV-1感染者全血,分离淋巴细胞并提取总RNA,经RT-PCR扩增人轻链基因和重链Fd基因.运用噬菌体展示技术,构建噬菌体抗体库,经过3轮"吸附-洗脱-富集"筛选,将获得的克隆进行诱导表达,表达产物经ELISA检测,筛选阳性抗HIV-1 Fab克隆;对获得的克隆进行抗体基因序列测定并分析序列同源性和互补决定区(CDRs);对获得的阳性克隆与轻链克隆CL8进行链置换并检测链置换前后抗体亲和力的变化;对获得的克隆进行诱导表达及纯化,同时进行中和试验.结果 构建了库容为8×106的噬菌体抗体库;经3轮筛选,获得11株抗HIV-1 Fab克隆,测序和序列分析显示,获得了 10条轻链和8条重链,它们和已经申请专利的部分HIV-1 gp120抗体的基因序列有较高的同源性(轻链同源性为60%～90%;重链同源性为71%～85%);CDRs分析显示,11株抗体CDRHs均比较长(12～20aa);链置换后的抗体亲和力并没有明显的改进;Fab诱导表达量均大于10 mg/L,利用重组HIV-1假病毒系统进行中和试验,结果显示,3株Fab具有一定的中和作用.结论 成功获得抗HIV-1抗体Fab,为进一步对其进行研究和应用奠定基础.     

敲除TSPAN1抑制人结肠癌细胞的生长和侵袭

目的 TSPAN1能够影响人结直肠癌细胞的增殖、扩散和侵袭。方法 用腺病毒同源重组的方法建立TSPAN1缺失的人结直肠癌HCT116细胞系,CCK-8、克隆形成、划痕和Transwell实验分别检测缺失TSPAN1的细胞生长速率、成瘤、迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验检测TSPAN1对肿瘤扩散的影响。双荧光素酶实验验证TSPAN1对雌激素受体和TGF-β受体活性的影响。结果 缺失TSPAN1的HCT116细胞的生长速率、成瘤、迁移和侵袭能力显著降低。在裸鼠中分别注射野生型和缺失TSPAN1的HCT116细胞,后者肿瘤扩散变慢,并且裸鼠的成活率提高。过表达TSPAN1能够激活雌激素受体和TGF-β受体。结论 TSPAN1可能通过雌激素受体和TGF-β受体通路来调节细胞增殖和侵袭过程,并且为治疗结直肠癌提供了潜在的新靶标。