SETD4对脂多糖诱导的AML12细胞IL-6转录的调控作用

目的　探讨SETD4（SET-domain containing protein 4）对脂多糖（LPS）诱导的AML12（小鼠肝脏细胞系）细胞IL-6的转录调控作用。 方法　构建SETD4表达质粒和IL-6 启动子荧光素酶报告基因质粒,共转染小鼠肝脏细胞系AML12,使用双荧光素酶报告基因技术检测LPS刺激后IL-6 启动子荧光素酶活性;单独转染SETD4表达质粒上调AML12细胞SETD4表达,检测LPS刺激后IL-6 mRNA水平变化。 结果　双酶切鉴定及核酸测序证实重组质粒pcDNA3.0/HA-SETD4、pGL3.0/IL-6 promoter的构建成功。pcDNA3.0/HA-SETD4与pGL3.0/IL-6 promoter共转染AML12细胞,LPS刺激后SETD4对IL-6 启动子荧光素酶活性没有影响;上调SETD4表达后,可以促进LPS诱导的IL-6 mRNA转录。 结论　成功构建SETD4真核表达质粒和IL-6启动子荧光素酶报告基因质粒;SETD4对LPS诱导的AML12细胞IL-6的转录发挥正调控作用。     

幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞白细胞介素-8基因转录的信号转导机制

背景:亚洲与欧美国家的幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因致病岛(cogPAI)存在地域差异,但此种差异与胃上皮细胞白细胞介素(IL)-8基因转录信号转导机制之间的关系尚不明确.目的:探讨我国H.pylori菌株诱导胃上皮细胞IL-8基因转录的信号转导机制.方法:以DNA杂交法分析长海医院5株临床分离H.pylori菌株的cagPAI状态.将含IL-8报告基因的人胃上皮细胞系L5F11分别与5株H.pylori共培养,或与各蛋白激酶(PK)抑制剂预作用1 h后再行共培养,用液体闪烁计数仪测定L5H11细胞的荧光素酶活性(IL-8基因转录),用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-8蛋白浓度.结果:在所分离的5株临床H.pylori菌株中,4株具有完整的cag PAI,1株cag PAI部分丢失.蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂除莠霉素A不仅能显著抑制H.pylori诱导的L5F11细胞的荧光素酶活性(P＜0.05或P＜0.01),而且能抑制其IL-8蛋白的分泌(P＜0.05或P＜0.01);PKG抑制剂KT5823和PKC抑制剂抑激酶素C对H.pylori诱导的IL-8基因转录和蛋白分泌均无影响.结论:与欧美国家的H.pylori菌株一样,本研究临床分离的H.pylori菌株亦通过PTK途径诱导胃上皮细胞IL-8基因转录.     

人MicroRNA-335阳性对照质粒真核表达载体的构建及意义

目的构建人MicroRNA-335(has-miR-335)阳性对照质粒表达载体。方法根据与has-miR-335"种子区"完全匹配的序列设计并合成一对互补的寡聚核苷酸链,经过缓慢降温退火得到目的小片段。将退火产物连接入荧光素酶报告基因载体p MIR-REPORT而得到has-miR-335阳性对照重组质粒。应用Lipofectamine 2000将has-miR-335阳性对照重组质粒、p MIR-REPORT空载体,分别与Pre-miRTMmicroRNA335 Precursor共转染至293T7/17细胞,用双荧光素酶方法检测has-miR-335在真核细胞中表达水平。结果获得has-miR-335阳性对照重组质粒,经测序结果正确。has-miR-335与其阳性对照结合在真核细胞中的表达下降。结论成功构建了has-miR-335阳性对照质粒表达载体。该载体可用于确认has-miR-335实验中RNA提取、转染和基因表达检测方法是否可靠。has-miR-335双荧光素酶报告基因检测体系的建立为进一步进行has-miR-335靶基因检测及验证奠定基础。     

双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响。方法运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3′UTR(LATS2-3′UTR-WT)及突变型3′UTR(LATS2-3′UTR-MU)片段,构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化。结果 Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3′UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3′UTR-MU+miR-31组相比,LATS2-3′UTR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03 vs.1.00±0.03,P0.05),而LATS2-3′UTR-MT+miR-31组与LATS2-3′UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02 vs.1.00±0.03,P0.01);AngⅡ诱导48h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P0.01)及β-MHC表达上调(P0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P0.01),LATS2基因明显下调(P0.05),96h后心肌细胞表面积明显增大。结论 miR-31可通过与LATS2基因3′UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大。     

在体光学分子影像技术在乳腺癌基础及临床研究中的应用

在体光学分子影像作为一种快速发展的生物医学影像技术,以其实时、定量及非侵入性等特点,已被广泛应用于各学科的研究中.光学分子影像技术在监测乳腺癌的远处转移、检测肿瘤细胞的凋亡、细胞周期、细胞乏氧与肿瘤血管生成、观察ER介导的分子路径、观察乳腺癌干细胞等基础研究领域及在乳腺癌早期诊断、引导前哨淋巴结活组织检查、药物疗效评价、检测乳腺癌原癌基因人类表皮生长因子受体2 (HER-2)表达等基础研究及临床应用中有着良好的前景.     

HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系在评价焦炉逸散物毒性中的应用

目的 探讨利用含HSPA1A(HSP70-1)启动子荧光素酶报告基因质粒的稳定转染HepG2/HSPA1A细胞评价焦炉逸散物毒性的可行性.方法 构建含HSPA1A启动子的pGL4.17/HSPA1A重组质粒并转染人HepG2细胞,建立稳定细胞株HepG2/HSPA1A.用不同浓度的炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒HepG2/HSPA 1A细胞24h,分别测定细胞的相对荧光素酶活力、存活率、丙二醛(MDA)含量、Olive尾距和微核率.结果 与对照组相比,炉底焦炉逸散物染毒组细胞的相对荧光素酶活力明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).且在0.15 μg/L时,细胞的相对荧光素酶活力最高,为对照组的1.4倍.细胞的相对荧光素酶活力分别随着炉侧和炉顶焦炉逸散物浓度的增加而逐渐增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).且在最高浓度时(65.4 μg/L,202 μg/L)细胞的相对荧光素酶活力分别为对照组的2.1和5.3倍.仅炉底焦炉逸散物染毒后细胞的相对荧光素酶活力与MDA浓度呈正相关,差异有统计学意义(r=0.404,P＜0.05).炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活力均与Olive尾距、微核率呈正相关(r尾距分别为0.476、0.940、0.788,r微核率分别为0.580、0.649、0.432),P＜0.05.结论 HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活力可以敏感地反映焦炉逸散物的毒性效应,该细胞可用于快速评估职业环境复合污染物的综合毒性效应.     

pGL3-Basic-COX-2-promoter:报告基因重组质粒的构建及其功能鉴定

目的:构建COX-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒 pGL3-Basic-COX-2-promoter,并进行功能鉴定.方法:根据已知人的COX-2基因启动子序列设计两端引物,扩增人基因组DNA中的COX-2启动子.载体质粒pGL3-Basic和COX-2启动子分别用限制性内切酶HindⅢ和Bgl Ⅱ 双酶切,将COX-2基因启动子插入到pGL3-Basic报告载体中.构建的pGL3-Basie-COX-2-promoter重组质粒和内参质粒pRL-SV40瞬时共转染胃癌MKN45细胞,加入100倍细胞数量的Hpylori共培养不同时间后,检测双荧光素酶的活性.结果:成功构建COX-2基因启动子重组质粒pGL3-Basie-COX-2-promoter,质粒测序及酶切结果完全正确.瞬时转染实验显示,COX-2启动子在MKN45细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后40 h的双报告基因活性是转染后8 h的3.5倍(P＜0.01);加入Hpylori共培养后,同时间点的荧光素酶活性明显升高(P＜0.05或0.01),转染后40 h的活性是转染后8h的5倍(P＜0.01).结论:pGL3-Basic-COX-2-promoter在胃癌MKN45细胞中能被转录激活,加入Hpylon刺激后COX-2活性显著增强,pGL3-Basic-COX-2-promoter可以用来鉴定和检测细胞中,COX-2的水平.     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测

【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。