miR-142-3p靶向调控mll-af4融合基因的实验研究

本研究探讨mll-af4融合基因的表观遗传学调控机制,以筛选靶向调控mll-af4融合基因的microRNA。利用Targetscan在线分析软件预测特异性靶向mllaf4基因3′端非翻译区域（3′-untranslated region,3′UTR）的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增mll-af4基因3′UTR序列,插入经EcoRI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-142-3p mimics以脂质体Hiperfect转染至RS4;11细胞,选用实时定量PCR及Western blot检测mll-af4 mRNA及蛋白的表达。结果表明,成功构建了含有1935bp、2104bp和1371bp的mll-af4基因3′UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-AF4-3′UTR,并通过酶切及基因测序方法鉴定得到证实。荧光素酶报告实验提示,miR-142组荧光素酶活性明显低于对照组。RS4;11细胞中过表达miR-142-3p可以明显下调MLL-AF4融合蛋白及mRNA表达。结论：miR-142-3p通过靶向结合mll-af4基因3′UTR的结合位点特异调控mll-af4基因表达。     

miRNA-570调控ATP合成酶G亚基的表达促进血小板凋亡

目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM_006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 bp),通过在序列两端增加限制酶酶切位点,与双荧光素酶报告基因载体(psiCHECK~(TM)-2)质粒连接,分别构建含有ATP5L 3′UTR的WT和MT的双荧光素酶报告基因载体。依据miRNA数据库中MI0003577人的序列分别合成miRNA-570序列和其阴性序列,分别与构建的双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞,依据转染物的不同将实验分为6组,实验组1:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;实验组2:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;阴性对照组1:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;阴性对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;空白对照组1:miRNA-570序列和psiCHECK-2质粒;空白对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-2质粒。转染48 h后利用生物发光检测仪检测转染细胞的相对荧光强度。收集单采血小板60 mL,利用脂质体方法转染血小板,依据转染物的不同,将实验分为4组,实验组A:miRNA-570序列;阴性对照组B:miRNA-570阴性对照序列;空白对照组C:脂质体2000;空白对照组D:空白(无转染物);分别转染转染血小板,24 h后收集血小板,流式细胞仪检测血小板膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻表达,Western blot检测血小板半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达,ELISA方法检测血小板Caspase-3活性。结果分别成功构建了psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT和-MT的双荧光素酶报告基因质粒载体。转染293T细胞测定的相对荧光强度:实验组1、实验组2、阴性对照组1、阴性对照组2、空白对照组1、空白对照组2分别为0.673±0.080、0.967±0.059、0.97±0.076、0.96±0.075、0.97±0.067、1.0±0.1(P0.05)。实验组A、阴性对照序列组B、空白对照组C、空白对照组D转染血小板24 h时PS表达阳性率(%):分别为5.43±0.61、3.27±0.64、3.25±0.68、3.20±0.36(P0.05);血小板中Caspase-3活性形式(%):分别为12.24±2.74、6.06±1.08、6.00±1.73、5.67±1.53(P0.05);光密度(OD)值(%):分别为0.21±0.029、0.096±0.04、0.09±0.04、0.087±0.025(P0.05)。结论 ATP5L-3′UTR有可与miRNA-570结合的靶位点,miRNA-570调控ATP5L基因的表达,提示miRNA-570可对ATP合成造成影响;miRNA-570可增加PS表达阳性率和Caspase-3活性,提示miRNA-570可对血小板凋亡产生影响。     

压力超负荷致小鼠心肌肥厚中miR378对热休克转录因子1的调节作用

目的:探讨miR-378在压力超负荷致小鼠心肌肥厚中对热休克转录因子1(HSF1)的调节作用及机制。方法:采用C57B/L6雄性小鼠经主动脉缩窄构建心肌的压力超负荷(TAC)模型,2周后对小鼠进行心脏超声和血流动力学测定,并观察miR-378和HSF1的表达变化。体外培养心肌细胞,机械牵张刺激24 h后观察miR-378和HSF1的表达变化;对心肌细胞分别转染miR-378模拟物和抑制物,48 h后观察心肌细胞内源性HSF1的表达变化;通过荧光素酶基因报告系统,检测miR-378是否靶向结合其预测靶点HSF1的3′UTR区域。结果:建模TAC小鼠2周后,心脏表现为代偿性心肌肥厚,HSF1表达升高而miR-378表达下降。心肌细胞机械牵张后HSF1表达升高而miR-378表达下降;心肌细胞过表达miR-378后,HSF1表达显著下降,而当抑制内源miR-378时,HSF1表达显著升高;荧光素酶报告系统证实miR-378能够靶向结合HSF1的3′UTR序列。结论:在心肌肥厚代偿期,miR-378可能通过靶向结合HSF1的3′UTR序列调节心肌内源性HSF1的表达。     

miR-15b-5p通过靶向LATS2基因调控 前列腺癌细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的探讨miR-15b-5p靶向大肿瘤抑制分子(LATS2)基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭、迁移及凋亡的影响及机制。方法将anti-miR-15b-5p及anti-miR-15b-5p+si-LATS2(同时抑制miR-15b-5p和LATS2表达)转染前列腺癌PC-3细胞,48 h后,通过qRT-PCR检测miR-15b-5p mRNA表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告系统检测miR-15b-5p与LATS2的靶向关系。Western blotting检测LATS2、β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达。结果 PC-3细胞转染anti-miR-15b-5p后,miR-15b-5p mRNA表达明显降低,细胞侵袭和迁移能力明显降低,细胞凋亡率明显升高(P 0. 05)。miR-15b-5p与LATS2存在靶向关系,抑制LATS2表达后可明显减弱anti-miR-15b-5p对PC-3细胞侵袭、迁移、凋亡及β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达的影响(P 0. 05)。结论抑制miR-15b-5p可明显降低前列腺癌PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其机制与靶向LATS2抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

人乳腺癌上皮细胞miR-217对DNMT1调控作用的研究

目的 验证在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达,为后期动物实验和临床试验提供实验基础.方法 利用瞬时转染技术,在对应细胞系中,过表达、抑制miR-217,Western blot检测各实验组中DNMT1蛋白表达,并用含有miR-217野生型及突变型识别位点的DNMT1 3′UTR载体质粒分别转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性改变.结果 过表达miR-217,DNMT1表达下降;抑制miR-217,DNMT1表达增高;双荧光素酶检测实验,DNMT1-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于DNMT1-UTR-MUT,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217对DNMT1表达具有调控作用,且miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达.     

miR-26a靶向调控AP-2γ表达对神经母细胞瘤细胞增殖的影响

[目的]探讨miR-26a是否可通过靶向调控AP-2γ表达而抑制神经母细胞瘤细胞增殖.[方法]通过双荧光素酶基因分析检测miR-26a对AP-2γ 3＇非编码区（3＇UTR）-荧光素酶的影响;采用Western blot方法检测miR-26a模拟物转染神经母细胞瘤细胞中AP 2γ表达水平;将AP-2γ shRNA转染SK-N AS细胞,MTS细胞增殖活性检测分析干扰AP-2γ表达对神经母细胞瘤细胞增殖能力.[结果]双荧光素酶活性检测显示miR-26a特异性地与AP-2γ的3＇UTR结合,抑制其荧光素酶活性.过表达miR-26a的神经母细胞瘤细胞AP2γ蛋白表达水平降低;shRNA干扰AP-2γ表达能抑制SK-N-AS细胞的增殖能力.[结论]miR-26a通过靶向调控AP-2γ表达而抑制神经母细胞瘤细胞的增殖.     

过表达miR-129-5p对胶质瘤细胞增殖、迁移 及CDK6、N-cadherin表达的影响

目的:研究过表达miR-129-5对胶质瘤细胞增殖、迁移及细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达的影响。方法:培养胶质瘤U87细胞并分为转染阴性对照mimic的对照组、转染miR-129-5p mimic的miR-129-5p组,采用MTS实验检测增殖活力、划痕实验检测迁移活力、Western blot检测CDK6及N-cadherin的表达量,验证miR-129-5p对CDK6、N-cadherin的靶向调控作用。结果:miR-129-5p组的OD490值(0.78±0.15),明显低于对照组的(1.21±0.34)(P0.05);相对愈合面积(32.39±8.79)%,明显低于对照组的(73.39±17.85)%(P0.05);CDK6的表达量(0.28±0.09)及N-cadherin的表达量(0.34±0.08),明显低于对照组的(0.88±0.18)及(0.67±0.15)(P0.05);生物信息学分析及双荧光素酶报告表明miR-129-5p靶向调控CDK6、N-cadherin基因mRNA 3’UTR。结论:过表达miR-129-5p能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移,其机制可能与靶向调控CDK6、N-cadherin有关。     

miR-30c-2-3p调控X-box结合蛋白-1对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨miR-30c-2-3p调控X-box结合蛋白-1(X box-binding protein-1,XBP1)对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法制备新生大鼠心肌细胞,随机分为对照组、缺氧/复氧组和miR-30c-2-3p处理组。对照组心肌细胞正常培养,缺氧/复氧组和miR-30c-2-3p处理组心肌细胞进行缺氧3h/复氧6h处理;miR-30c-2-3p处理组心肌细胞于缺氧前48h采用miR-30c-2-3p抑制剂转染慢病毒,对照组和缺氧/复氧组感染慢病毒包装的无义寡核苷酸序列。复氧6h后,采用比色法检测3组心肌细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率,流式细胞术检测正常心肌细胞比率及凋亡水平,实时荧光定量PCR法检测miR-30c-2-3p和XBP1mRNA表达水平,Western blot法检测XBP1蛋白表达情况,双荧光素酶基因检测验证miR-30c-2-3p和XBP1的靶向关系。结果缺氧/复氧组和miR-30c-2-3p处理组心肌细胞LDH漏出率[(28.8±4.9)%、(22.2±3.0)%]、细胞凋亡率[(28.5±3.9)%、(19.2±2.6)%]、miR-30c-2-3p(2.87±0.57、1.57±0.21)、XBP1mRNA(1.68±0.68、3.96±0.69)和XBP1蛋白(1.96±0.40、2.73±0.61)表达均高于对照组[(4.6±1.1)%、(6.5±1.2)%、1、1、1],正常心肌细胞比率[(63.8±4.2)%、(71.6±4.0)%]低于对照组[(91.4±2.4)%](P0.05);miR-30c-2-3p处理组心肌细胞LDH漏出率、细胞凋亡率及miR-30c-2-3p表达低于缺氧/复氧组,正常心肌细胞比率、XBP1mRNA和XBP1蛋白表达高于缺氧/复氧组(P0.05);双荧光素酶基因检测结果证实,XBP1为miR-30c-2-3p的靶基因。结论在大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,miR-30c-2-3p、XBP1及XBP1蛋白呈高表达,抑制miR-30c-2-3p可通过上调XBP1表达来减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

miR-34a靶向调控HDAC1基因对急性髓系白血病细胞凋亡的影响

目的:探讨急性髓系白血病细胞中miR-34a对HDAC1的调控作用以及对细胞凋亡的影响。方法:将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、miR-34a scramble转染到HL-60细胞中,采用CCK8试验和流式细胞术分别检测miR-34a不同表达水平对HL-60细胞增殖和凋亡的影响。应用Western blot检测miR-34a表达改变后HDAC1蛋白表达水平。构建含HDAC1 3′UTR的双荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶报告实验验证miR-34a与HDAC1的作用位点。构建不含HDAC1 3′UTR的表达载体,应用回复实验验证miR-34a与HDAC1的相互作用。结果:miR-34a过表达可导致HL-60细胞的增殖抑制、凋亡率增加。生物信息学分析表明,HDAC1是miR-34a的靶基因;Western blot结果显示,miR-34a高表达可下调HDAC1蛋白表达,双荧光素酶实验和回复实验显示,miR-34a可作用于HDAC1 3′UTR区,调理其表达。结论:miR-34a促进HL-60细胞凋亡,其作用可能与其对HDAC1表达调控有关。     

miR-29a靶向调控IFITM3表达对肝癌HepG2细胞生长、增殖和凋亡的影响

目的探究微小RNA-29a(miR-29a)靶向调控干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达对肝癌HepG2细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌细胞HepG2和正常肝细胞株LO2中miR-29a的表达水平;采用脂质体法将miR-29a minmic及阴性对照转染至HepG2细胞,并分为过表达组和对照组,转染48 h后用QRCR法检测两组miR-29a水平;采用MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖及凋亡情况; Western blotting检测各组Bax、caspase-3凋亡相关基因及IFITM3的表达;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a对IFITM3的靶向调控作用。结果肝癌HepG2细胞miR-29a水平低于正常LO2细胞(P 0. 05);过表达组HepG2细胞miR-29a表达低于对照组(P 0. 05);过表达组HepG2细胞增殖率低于对照组(P 0. 05),凋亡率及Bax、caspase-3、IFITM3表达高于对照组(P 0. 05); miR-29a可显著抑制野生型FITM3-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(P 0. 05),但其对突变型FITM3-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性无显著影响(P 0. 05)。结论 miR-29a在肝癌中表达降低,可靶向调控IFITM3表达,抑制肝癌细胞生长、增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌的潜在治疗靶点。     

miR-217调控TIMP3的表达对喉癌细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-217调控金属肽酶抑制剂3(metallopeptidase inhibitor 3, TIMP3)的表达对喉癌细胞生物学行为的影响。方法选择喉癌并行喉部分切除术或喉全切除术的癌组织32例,同时取距离肿瘤2 cm的癌旁正常喉组织32例。选择人喉癌细胞株Hep2,并将miR-217 mimics、Control mimics转染至细胞,分别作为miR-217 mimics组与miR-217 NC组,再将TIMP3 3'-UTR野生型(Wt)质粒和TIMP3 3'-UTR突变型(Mut)质粒分别转染细胞。实时定量核酸扩增检测(qPCR)miR-217及TIMP3的表达水平,双荧光素酶实验检测验证miR-217与TIMP3在喉癌Hep2细胞株中的调控关系,MTT增殖实验检测细胞增殖数,Transwell检测细胞迁移、侵袭数,分析miR-217在喉癌组织中的表达与其临床特征的相关性。结果 qPCR检测结果显示,癌旁正常喉组织、喉癌组织的miR-217表达量分别为1.53±0.21、0.68±0.13,TIMP3表达量分别为1.18±0.15、0.31±0.08,比较差异有统计学意义(P0.05)。双荧光素酶实验结果显示,miR-217 mimics+TIMP3 3'-UTR Wt组、miR-217 NC+TIMP3 3'-UTR Wt组、miR-217 mimics+TIMP3 3'-UTR Mut组、miR-217 NC+TIMP3 3'-UTR Mut组的荧光素酶活性分别为1.79±0.31、1.15±0.11、1.28±0.28、1.18±0.19,比较差异有统计学意义(t=12.09,P=0.019);miR-217 mimics+TIMP3 3'-UTR Wt组、miR-217 NC+TIMP3 3'-UTR Wt组双荧光素酶活性比较差异有统计学意义(P0.05)。与miR-217 NC组比较,miR-217 mimics组喉癌细胞增殖数、迁移细胞数及侵袭细胞数降低,差异有统计学意义(P0.05)。miR-217表达与喉癌的病理分期及淋巴结有无转移相关(P0.05)。结论 miR-217调控TIMP3表达以抑制喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-181a靶向RASSF1A促进多发性骨髓瘤U266细胞增殖、侵袭

目的探讨miR-181a靶向Ras相关区域家族1(RASSF1A)促进多发性骨髓瘤U266细胞增殖、侵袭的作用。方法收集40例多发性骨髓瘤患者骨髓组织及50例受试者的正常骨髓组织标本;培养多发性骨髓瘤U266细胞,并分为NC mimic组、miR-181a mimic组、NC inhibitor组、miR-181a inhibitor组。采用MTS法检测细胞增殖活力;Transwell试验检测细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR检测各组miR-181a的表达水平;western blot检测RASSF1A、cyclinD1、RhoA蛋白的表达水平;荧光素酶报告试验验证miR-181a靶向RASSF1A 3′非翻译区(UTR)。结果实时荧光定量PCR结果显示,多发性骨髓瘤组织中miR-181a的表达量明显高于正常骨髓组织(P均<0.05);western blot检测结果显示,多发性骨髓瘤组织中cyclinD1、RhoA蛋白的表达量明显高于正常骨髓组织(P均<0.05),而RASSF1A蛋白的表达量明显低于正常骨髓组织(P<0.05);western blot检测结果还显示,miR-181a mimic组cyclinD1、RhoA蛋白的表达量明显高于NC mimic组(P均<0.05),而miR-181a inhibitor组cyclinD1、RhoA的表达量明显低于NC inhibitor组(0.32±0.07 vs 0.71±0.12,0.39±0.06 vs 0.66±0.10,P均<0.05);Transwell试验结果表明,miR-181a mimic组侵袭细胞数(个)明显高于NC mimic组(38.59±7.41 vs 10.29±2.12,P<0.05),而miR-181a inhibitor组侵袭细胞数(个)明显少于NC inhibitor组(7.28±1.24 vs 11.41±2.76,P<0.05);荧光素酶报告试验结果表明,miR-181a mimic组RASSF1A的表达量及RASSF1A 3′UTR荧光素酶报告基因的荧光活力均明显低于NC mimic组(0.81±0.15 vs 1.54±0.26,0.173±0.035 vs 0.291±0.062,P均<0.05),而miR-181a inhibitor组RASSF1A的表达量及RASSF1A 3′UTR荧光素酶报告基因的荧光活力明显高于NC inhibitor组(1.83±0.31 vs 1.25±0.21,0.399±0.067 vs 0.273±0.057,P均<0.05)。结论miR-181a能够促进多发性骨髓瘤U266细胞的增殖、侵袭,并靶向抑制RASSF1A的表达。     

miR-335-5p/ADCY3诱导的再生障碍性贫血患者免疫异常的机制研究

目的:探究miR-335-5p/ADCY3失衡对获得性再生障碍性贫血(AA)患者淋巴细胞功能的影响。方法:采集AA患者外周血标本50例,其中重型再生障碍性贫血(SAA)38例,非重型再生障碍性贫血(NSAA)12例,同时采集健康志愿者(HC)外周血标本22例。标本分离单个核细胞(PBMNC)后,用RT-PCR检测miR-335-5p及ADCY3 mRNA的表达量。用RNAimax转染试剂,将阴性对照miR-335-5p及miR-335-5p mimic分别转染至AA患者的PBMNC,流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞增殖、活化及分泌细胞因子的能力。应用双荧光素酶报告基因系统验证miR-335-5p与靶基因的靶向关系。结果:同HC来源的PBMNC(HC-PBMNC)相比,SAA和NSAA来源的PBMNC中miR-335-5p的表达量均明显降低(0.08±0.01 vs 0.74±0.10,P0.01**;0.17±0.02 vs 0.74±0.10,P0.01**)。而且,SAA来源的PBMNC中miR-335-5p的表达量显著低于NSAA(P0.01**)。与对照组相比,体外上调miR-335-5p的表达,AA来源的PBMNC(AA-PBMNC)中,CD4+T和CD8+T细胞增殖能力均明显降低(P0.05*和P0.05*)。而且上调miR-335-5p的表达可显著抑制AA-PBMNC中CD4~+和CD8~+T细胞的活化(P0.01**和P0.01**)。此外,上调AA-PBMNC中,miR-335-5p的表达还可明显降低CD4~+TNFα~+T细胞、CD8~+IFNγ~+T细胞和CD8~+TNFα~+T细胞的比例(P0.01、P0.05和P0.05)。靶基因筛查显示,ADCY3在AA-PBMNC中的表达量明显高于HC-PBMNC (1.70±0.15 vs 0.76±0.12,P0.001)。而且,miR-335-5p可显著抑制ADCY3 3′UTR野生型质粒的荧光素酶活性(P0.05)。结论:MiR-335-5p在AA-PBMNC中显著低表达,且与疾病严重程度相关。体外上调AA-PBMNC中miR-335-5p的表达量可纠正患者免疫异常状态。这些改变可能与靶基因ADCY3的抑制增强有关。     

miR-152通过调控FOXR2表达抑制人前列腺癌细胞增殖的研究

目的探讨人前列腺癌PC-3细胞中miR-152调控叉头框蛋白R2(FOXR2)对细胞增殖的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测人正常前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌PC-3细胞中miR-152、FOXR2 mRNA的相对表达水平,Western blot检测FOXR2蛋白水平。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor或FOXR2-siRNA转染PC-3细胞后,观察细胞增殖能力的变化。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor分别与FOXR23′UTR双荧光素报告基因质粒共转染PC-3细胞,检测荧光素酶活性。miR-152 mimics和miR-152 inhibitor转染PC-3细胞后,检测miR-152、FOXR2 mRNA的相对表达水平及FOXR2蛋白水平。结果与RWPE-1细胞比较,PC-3细胞中miR-152的相对表达水平显著降低(P=0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著升高(P=0.003、0.003)。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor或FOXR2-siRNA转染PC-3细胞后,细胞增殖能力分别显著降低、升高、降低(P=0.022、0.029、0.006)。miR-152 mimics和FOXR23′UTR野生型质粒共转染后荧光素酶活性被显著抑制(P=0.001),而共转染miR-152 inhibitor可显著增加荧光素酶活性(P=0.001)。与对照组比较,miR-152 mimics转染PC-3细胞后,miR-152的相对表达水平显著升高(P<0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著降低(P<0.001、0.001),细胞活性显著降低(P=0.013);miR-152 inhibitor转染PC-3细胞后,miR-152的相对表达水平显著降低(P<0.001),而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著升高(P<0.001、P=0.007),细胞活性显著升高(P=0.018)。结论miR-152可通过负调控FOXR2表达发挥抑制人前列腺癌PC-3细胞增殖的作用。     

胃癌患者血清和组织miR-30a表达与胃泌素及患者临床病理特征的相关性研究

目的探讨胃癌患者血清和组织中miR-30a表达情况与血清胃泌素-17(G-17)及患者临床病理特征的关系。方法选取2018年3月至2019年12月在重庆医科大学附属第一医院大足医院确诊的68例初诊胃腺癌患者作为研究对象,采集血样和胃癌组织、癌旁正常组织标本;另选取同期30例健康者血清标本作为对照组。提取血清和组织总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-30a相对表达量,另外检测血清G-17水平。采用双荧光素酶报告基因分析miR-30a和胃泌素基因(GAST)的靶向调控关系。结果 GEPIA数据库和OncomiR数据库分析显示,胃癌组织GAST表达量较癌旁正常组织升高,差异有统计学意义(P0.05),胃癌组织中miR-30a表达量低于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P0.05),且GAST与miR-30a表达量呈明显负相关(r=-0.520,P0.05)。双荧光素酶报告基因分析显示,miR-30a mimics和GAST-3′UTR-WT共转染,荧光素酶相对表达量降低(P0.05)。与健康者血样或相配对的癌旁正常组织比较,胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量[血清:(0.688±0.279)vs.(1.000±0.200),t=5.524,P0.05;胃癌组织:(0.348±0.244)vs.(1.000±0.175),t=13.211,P0.05]明显降低,且与肿瘤直径、TNM分期、血清癌胚抗原、糖类抗原(CA)19-9、CA 125水平及幽门螺杆菌感染均有关(P0.05)。Pearson相关分析显示,胃癌患者血清miR-30a相对表达量与血清G-17水平呈负相关(r=-0.729,P0.05)。结论胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量普遍降低,与血清G-17过表达有关,而且GAST基因是miR-30a潜在的下游靶基因,miR-30a/胃泌素有望成为胃癌治疗的新靶点。     

Circ0066629促进结直肠癌细胞活力的体外研究

目的探讨环状RNA circ0066629促进结直肠癌细胞活力作用及其调控的分子机制。方法 35例结直肠癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)及伊立替康耐药和不耐药患者组织来源于南京医科大学附属上海市松江中心医院,不同结直肠癌细胞系来源于美国菌种保藏中心,利用RT-q PCR测定circ0066629在结直肠癌组织及细胞系中的表达水平。Circ0066629过表达质粒、siRNA质粒、miR-219a-2-3p过表达质粒(miR-219a-2-3p mimics)及miR-219a-2-3p干扰质粒(miR-219a-2-3p inhibitor)用于调控circ0066629和miR-219a-2-3p的表达。RT-q PCR用于测定转染效率。随后,应用CCK-8和细胞划痕实验测定LOVO细胞活力。荧光素酶报告基因实验用于评估circ0066629与miR-219a-2-3p以及p53与miR-219a-2-3p的靶向关系。蛋白免疫印迹实验用于测定p53和鼠双微体基因2(MDM2)在LOVO细胞中的蛋白表达水平。结果 circ0066629在结直肠癌5-Fu及伊立替康耐药患者组织中表达下调,但在不同结直肠癌细胞系中表达上调。过表达circ0066629明显促进了5-Fu和伊立替康处理下的LOVO细胞活力。MiR-219a-2-3p被预测为circ0066629的靶基因,并且miR-219a-2-3p过表达对LOVO细胞活力的作用与circ0066629相反。另外,p53是miR219a-2-3p的预测靶向基因,p53特异性抑制剂(PFT-α)明显抑制LOVO细胞活力。结论 circ0066629通过调控miR-219a-2-3p/P53/MDM2轴促进结直肠癌细胞活力。     

MiRNA-218对PAG1的调控及其对卵巢癌干细胞的影响

目的:研究miR-218在卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs)中的表达,并探讨其对PAG1的调控作用和对OCSCs的影响及作用机制。方法:收集卵巢癌患者新鲜肿瘤组织,分离培养原代卵巢癌细胞,用流式细胞仪筛选出CD133~+表型的OCSCs。采用Western印迹法检测干性特异相关基因Nanog和Sox2蛋白的表达。qRT-PCR检测miR-218在OCSCs中的表达。miR-218 mimic转染OCSCs,分为miR-218mimic组和miR-218NC组,MTS检测各组OCSCs增殖;软琼脂克隆实验检测各组OCSCs肿瘤球形成能力的影响;miR-218过表达慢病毒质粒及对照质粒vector感染OCSCs,经1.0μg/mL嘌呤霉素筛选稳定过表达miR-218或vector的OCSCs细胞,注射到BALB/c裸鼠中,观察miR-218对OCSCs体内成瘤能力的影响。Targetscan7.2预测软件及双荧光素酶报道基因试验,分析miR-218对PAG1基因的靶向作用,qRT-PCR检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中PAG1mRNA的表达。Western印迹法检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达。结果:Nanog和Sox2蛋白在CD133~+表型OCSCs中的表达显著高于CD133-表型OCSCs中的表达;miR-218在CD133~+表型OCSCs中的表达显著低于CD133-表型OCSCs中的表达(P0.05)。miR-218mimic组OCSCs增殖减慢,OCSCs肿瘤球形成能力下降。OCSCs_(miR-218)裸鼠成瘤体积显著低于OCSCsvector组(P0.05)。TargetScan7.2软件预测和双荧光素酶报道基因试验证实PAG1为miR-218的靶基因,miR-218 mimic组PAG1 mRNA的表达减少。Western印迹法检测miR-218 mimic组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达显著减少。结论:MiR-218在OCSCs中低表达,可能通过靶向下调PAG1,抑制pSrc和pAKT蛋白的表达影响OCSCs的干性。     

miR-33b靶向HMGA2基因表达抑制食管癌细胞迁移的实验研究

目的研究miR-33b靶向高迁移率族蛋白A2(HMGA2)基因表达抑制食管癌细胞迁移的作用。方法培养食管癌Eca9706细胞,转染阴性对照(NC)模拟物、miR-33b模拟物、NC-siRNA、HMGA2-siRNA、pcDNA3.0空白质粒、pcDNA3.0-HMGA2质粒后,采用Transwell及划痕实验检测细胞的迁移,采用荧光定量PCR及western blot检测mi R-33b、HMGA2表达量,采用双荧光素酶报告基因验证miR-33b对HMGA2的靶向调节作用。结果转染miR-33b模拟物后mi R-33b的表达量明显增加,HMGA2的表达量明显减少,细胞的迁移明显受到抑制;转染HMGA2-siRNA后HMGA2的表达量明显减少,细胞的迁移明显受到抑制;转染pcDNA3.0-HMGA2质粒后HMGA2的表达量明显增加且miR-33b抑制细胞迁移的作用发生逆转;双荧光素酶报告基因证实miR-33b靶向HMGA2 m RNA的3’UTR。结论 miR-33b直接靶向HMGA2并抑制食管癌细胞的迁移。     

利用果蝇细胞研究基因表达转录后调控的双报告基因系统的建立

目的 构建能够在果蝇S2＊细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海洋腔肠荧光素酶的质粒pAc-Rluc.将TNF-α基因mRNA的3＇UTR连接至pAc-Fluc的Luc编码区下游构建pAc-Fluc-TNF-α质粒,并与pAc-Rluc共转至果蝇S2＊细胞,检测两种荧光素酶的相对活性.结果 成功构建了能够在果蝇S2＊细胞中组成型表达的双报告基因系统;在TNF-α mRNA 3＇UTR控制下表达的荧光素酶活性比对照有显著下降.结论 可以利用该双报告基因系统在果蝇细胞中研究转录后调控元件对基因的表达调控.     

MiR-144-3p靶向SGK3通过Hippo信号通路抑制卵巢癌的生长和侵袭

目的:探讨miR-144-3p对卵巢癌生长和侵袭的作用及机制。方法:RT-qPCR检测正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞miR-144-3p与SGK3mRNA的表达,双荧光素酶报告检测靶向关系,将卵巢癌SKOV3细胞分为对照组(Control组)、模拟物对照组(mimic-NC组)、miR-144-3p高表达组(miR-144-3p mimic组)、SGK3高表达组(pc-SGK3组)、miR-144-3p和SGK3都高表达组(miR-144-3p+SGK3组),CCK-8法检测细胞增殖,克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹分析检测p-MST,p-LATS,p-YAP,MST,LATS,YAP蛋白表达水平;裸鼠后肢腹侧皮下注射SKOV3细胞悬液构建移植瘤,每周检测移植瘤体积,第30天颈椎脱位法处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤,电子天平称重,蛋白质印迹分析检测SGK3,p-MST,p-LATS,p-YAP,MST,LATS,YAP蛋白表达水平。结果:MiR-144-3p在卵巢癌细胞中低表达,而SGK3高表达;miR-144-3p靶向负调控SGK3;miR-144-3p过表达能够明显减弱卵巢癌细胞增殖、减少每视野中卵巢癌细胞克隆数目,减短细胞周期,增加细胞凋亡率,减少侵袭细胞数目、上调p-MST/MST,p-LATS/LATS,p-YAP/YAP蛋白表达(P0.01),再加入SGK3高表达和Hippo信号通路抑制剂XMU-MP-1后均能逆转上述反应。结论:MiR-144-3p靶向SGK3通过Hippo信号通路抑制卵巢癌的生长和侵袭。