miR-1290与RASAL2基因靶向关系的探索

目的通过构建RASAL2 3′-非翻译区(3′-UTR)双荧光素酶报告载体,探索RASAL2与非编码核糖核酸(ncRNA)miR-1290的靶向调控情况。方法借助在线数据库Targetscan预测miR-1290与RASAL2结合位点;利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增RASAL2基因3′-UTR序列,并以GV272为载体将其连接,分别构建野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR和突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR荧光素酶报告基因重组质粒;并将miR-1290及相应阴性对照分别与这两种重组质粒共转染到293T细胞中,通过检测各组荧光素酶活性,探索miR-1290与RASAL2基因的结合情况。结果酶切和测序数据表明:野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR及突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;相较于miR-1290与突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR共转染组,miR-1290与野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR共转染组的荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)。结论成功构建了RASAL2 3′-UTR的双荧光素酶报告基因载体,但miR-1290不能与RASAL2结合,不能抑制其表达。     

登革病毒IgG抗体的检测:基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）,用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义（P>0.05）;阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义（P>0.05）;重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。     

不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响

目的:探讨不同双荧光素酶实验方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响。方法:从胃癌细胞系BGC823基因组中提取T-细胞淋巴瘤侵袭转移诱导基因(TIAM1)的3’非编码区(3’-UTR)片段全长,将TIAM1-3’UTR构建在2种不同的荧光素酶基因质粒上,选择8个miRNAs进行双荧光素酶实验研究。结果:miR-10b的抑制物使2种质粒的相对荧光素酶活性均升高;miR-651和miR-653的抑制物使2种质粒的相对荧光素酶活性变化完全相反;miR-10b-5p的抑制物和类似物(mimic)分别使psi-TIAM1-3’UTR的相对荧光素酶活性增高和减弱;而miR-372-3p、miR-373-3p和miR-653-5p的抑制物和类似物处理组荧光素酶活性均升高,miR-335-3p的抑制物和类似物处理组荧光素酶活性均减低。结论:进行双荧光素酶实验时psi-TIAM1-3’UTR这类2种基因位于同一质粒且不以Renilla作为内参的质粒较为合适,并发现miR-10b-5p能够直接靶向作用于TIAM1-3’UTR。     

p53途径的双荧光素酶报告系统在食品致癌物筛选中的应用研究

目的应用p53途径的双荧光素酶报告系统筛选食品中的致癌物。方法双荧光素酶试验中,采用萤火虫荧光素酶检测食品中常见的致突变性/致癌性物质的p53基因表达水平,同时以海肾荧光素酶作为内对照。结果文献报道有致突变性/致癌性的8个样品中有7个双荧光素酶试验结果为阳性,而且阳性剂量低于大多数传统毒理试验,阳性样品的荧光素酶活性有随着处理剂量的增加而增高的趋势;缺乏致突变性/致癌性文献的隐色结晶紫的荧光素酶活性仅略有增加。结论 p53途径的双荧光素酶报告系统可能是一种比较理想的高通量食品致癌物筛选系统。     

聚乙烯亚胺介导的报告基因在体外转染效率的研究

目的　探讨阳离子聚合体载体PEI2 5 (分枝状 ,2 5KDa)在体外的转染效率。方法　PEI2 5和LipofectamineTM2 0 0 0作为转染试剂 ,瞬时转染CHO细胞系 ,通过检测荧光素酶来评估PEI和LipofectamineTM2 0 0 0的转染效率。结果　当N P =5 ,6 ,7时 ,PEI2 5的转染效率与LipofectamineTM2 0 0 0相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　经济实用的PEI适用于体外的瞬时转染。     

活体荧光成像技术评价X射线对小鼠乳腺癌移植瘤的治疗效果

目的 建立荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞爪垫淋巴结转移模型,监测肿瘤早期淋巴结转移,并用荧光成像评价X射线局部治疗效果。方法 将表达荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系4T1-Luc接种至裸鼠爪垫皮下,建立爪垫皮下淋巴结转移模型。通过裸鼠活体荧光成像系统连续观察肿瘤细胞在淋巴结中的转移情况,并将有早期淋巴转移的荷瘤裸鼠按随机数字表法分为对照组和治疗组,活体荧光成像系统观察治疗效果,HE染色观察评价病理形态学变化。结果 成功建立了小鼠乳腺癌淋巴结转移模型,爪垫原发灶肿瘤体积与荧光光子数呈正相关性（r=0.958,P<0.001）,在肿瘤接种的第24天,治疗组爪垫肿瘤和腘窝处肿瘤部位的荧光光子数较对照组呈显著性降低（t=32.58,P<0.05）;用荧光光子数计算抑瘤率高达85%以上。HE染色观察到治疗组较对照组移植瘤坏死明显。结论 运用活体生物发光成像技术能够动态、客观、灵敏、可视化地评估X射线对小鼠乳腺癌肿瘤的抑瘤效应。     

Metridia荧光素酶检测条件的优化

目的：探讨培养基pH、血清对Metridia荧光素酶（MLuc）检测的影响并尝试找到一种优化的检测条件。方法：构建表达MLuc的逆转录病毒载体,瞬时转染人宫颈癌细胞系HeLa,制备收获MLuc;利用化学发光仪检测不同条件下的培养基对MLuc发光性能的影响,并尝试通过不同缓冲液与试剂的组合代替培养基来获得最佳条件。结果：培养基pH变化导致MLuc发光值产生较大波动,血清的存在会导致检测背景;添加0.02%（V/V）NP-40的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4）作为MLuc检测的缓冲体系代替培养基,其发光值大小相当,检测背景值由原来的600左右降低到20左右。结论：以添加0.02% NP-40的PBS作为MLuc检测的缓冲体系可消除培养基pH、血清的影响,使检测结果更加准确和灵敏。     

基于荧光素酶报告基因的MCF7细胞雌激素样物质检测方法的建立

目的:建立基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素样物质检测方法,并研究2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(2,4-DDT)和甲氧氯(METH)的雌激素样作用.方法:合成人雌激素反应元件(ERE)核心片段并将其插入pGL3-promoter载体的多克隆位点,构建成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERE-Luc,用脂质体转染法将pERE-Luc及内对照质粒phRL-SV40瞬时转染MCF7细胞,用17β-雌二醇(E2)及受体拮抗剂三苯氧胺(TAM)等处理后检测报告基因荧光素酶的表达,并用雌激素样物质2,4-DDT和METH对方法的有效性进行验证.结果:构建了ERE调控的报告质粒pERE-Luc,转染pERE-Luc的MCF7细胞报告基因的表达与E2呈明显的剂量反应关系,1×10-11mol/L E2可引起报告基因表达,至1×10-9mol/L可达到最大表达值,而未转染pERE-Luc时与E2无明显反应,TAM可以显著抑制E2引起的报告基因的表达.验证结果表明,2,4-DDT浓度>1×10-7mol/L及METH浓度>1×10-6mol/L时可产生雌激素样活性,2,4-DDT的雌激素样活性强于METH.结论:建立的基于荧光素酶报告基因的体外雌激素样物质检测方法有效可靠,以此方法检测2,4-DDT和METH显示有明显的雌激素样活性作用.     

phP53-luc质粒的构建及其用于检测化学物质遗传毒性的初步分析

目的:构建2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,并探讨其用于检测遗传毒性化学物质的可行性.方法:通过PCR扩增人p53基因启动子片段,然后采用重组DNA技术克隆入pGL3-BASIC的荧光素酶报告基因的上游而获得phP53-luc表达质粒.用脂质体转染法将phP53-luc转染入NIH 3T3细胞并分别用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理,最后裂解细胞用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测荧光素酶报告基因表达.结果:构建了2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,位于这2个质粒上的荧光素酶报告基因在NIH 3T3细胞内的表达显著地受遗传毒性化学物质的诱导,其表达比对照的pGL3-BASIC载体上的荧光素酶报告基因高近240倍.结论:基于人p53基因启动子的荧光素酶报告基因分析系统可以用于快速检测环境毒物的遗传毒性.     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.