基因编辑技术的研究进展及其在中药研究中的前景展望

基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术,可对特定DNA片段进行敲除、加入和替换等,从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复,联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。基因编辑技术在科研、农业、医疗等领域都具有极其广泛的发展前景和应用价值。在疾病基因治疗领域,基因编辑技术在癌症如白血病、遗传性疾病如血友病、地中海贫血、多种肌肉营养障碍症和逆转录病毒相关传染病如艾滋病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩:结合基因编辑技术开展的实验新方法学研究及动物模型的制备工作也在迅猛地发展和完善;世界各地的实验室也已将基因编辑技术应用于预防疟疾、器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活等多个研究领域。该文就基因编辑技术在上述领域中的研究进展进行一些概括和总结。此外还归纳了一些当前针对基因编辑技术存在的争议和思考,并初步探讨了该技术在中药研究中的潜在应用前景。     

骨质疏松疫苗载体:Qβ病毒样颗粒的表达、鉴定和纯化

 目的 优化表达和纯化方式,制备出具有正确空间结构且纯度和产量较高的骨质疏松疫苗载体Qβ病毒样颗粒(Qβvirus-like particles,Qβ-VLPs)。方法 在基因合成时删除A1基因序列中Qβ衣壳蛋白终止密码子之后的序列,只合成Qβ衣壳蛋白的基因序列。将Qβ衣壳蛋白基因序列克隆到pET30a载体质粒上,用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)三种不同菌株进行蛋白表达,然后用SDS-PAGE和透射电镜验证是否表达出Qβ-VLPs的正确结构。设置2个蛋白表达诱导剂IPTG( Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度和3种菌体破碎方式,分别优化蛋白表达条件和菌体破碎方案,然后将得到的Qβ-VLPs上清液通过硫酸铵聚沉、高速离心和分子筛分选进行Qβ-VLPs的纯化。结果 仅BL21(DE3)pLysS菌株可以表达出SDS-PAGE中呈现5-6聚体、透射电镜下呈现25~30 nm球形结构的Qβ-VLPs。使用0.5 mM浓度的IPTG表达的Qβ-VLPs产量较0.2 mM时高2.8倍,使用超声破碎菌体的方式可以获得较高的蛋白分离效率。将Qβ-VLPs上清液通过本实验过程中的方案进行纯化后纯度可达90%左右。结论 该实验探索出具有正确空间结构、组成单一且纯度较高的Qβ-VLPs的制备方案,为相关疫苗制备和研究奠定基础。     

水溶性大豆异黄酮对破骨细胞分化和功能的影响

目的:研究水溶性大豆异黄酮(WSSI)对1,25-二羟基维生素D3诱导兔骨髓细胞分化形成破骨细胞样细胞以及兔成熟破骨细胞骨吸收功能的影响。方法:通过TRAP染色对骨髓细胞诱导分化形成的TRAP阳性多核巨细胞计数;用显微摄影结合计算机图像分析测定骨吸收造成的陷窝数目及表面积,以评价破骨细胞活性;用扫描电镜观察骨吸收陷窝的形态。结果:浓度为20.0、4.0、2.0和0.4μg/ml的水溶性大豆异黄酮既能抑制破骨细胞样细胞的形成(P<0.001),还能抑制成熟破骨细胞的骨吸收功能(P<0.001),具体表现在随着浓度的升高骨吸收陷窝数目及表面积减少。结论:WSSI可以明显抑制破骨细胞样细胞的形成和成熟破骨细胞的骨吸收功能。     

Metridia荧光素酶检测条件的优化

目的：探讨培养基pH、血清对Metridia荧光素酶（MLuc）检测的影响并尝试找到一种优化的检测条件。方法：构建表达MLuc的逆转录病毒载体,瞬时转染人宫颈癌细胞系HeLa,制备收获MLuc;利用化学发光仪检测不同条件下的培养基对MLuc发光性能的影响,并尝试通过不同缓冲液与试剂的组合代替培养基来获得最佳条件。结果：培养基pH变化导致MLuc发光值产生较大波动,血清的存在会导致检测背景;添加0.02%（V/V）NP-40的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4）作为MLuc检测的缓冲体系代替培养基,其发光值大小相当,检测背景值由原来的600左右降低到20左右。结论：以添加0.02% NP-40的PBS作为MLuc检测的缓冲体系可消除培养基pH、血清的影响,使检测结果更加准确和灵敏。     

PC12细胞硫氧还蛋白cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX)是广泛存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质，它含有保守的Cys-Gly-Pro-Cys活性位点，作为多效性细胞因子而具有重要的生物学功能，从PC12细胞中提取总RNA，经逆转录PCR（RT-PCR)扩增出硫氧还蛋白cDNA并克隆到PUC18质粒上，序列分析表明，克隆所得序列与GenBank中大鼠硫氧还蛋白cDNA序列完全一致。将该基因亚克隆到表达质粒pQE30上，质粒pQE30-TRX在大鼠杆菌M15中获得高效表达，带6His的融合蛋白约占总菌体蛋白的30％。分析鉴定表明，纯化的融合蛋白质分子量是14kD，且具有二硫键还原酶活性。     

中西医结合治疗性功能障碍114例

目的观察中西医结合治疗性功能障碍的疗效。方法采用自拟兴痿延时汤(生黄芪、白蒺藜、龙牡、茯神、芡实等药)配合西药氯丙咪嗪、西地那非与单纯使用比法尔治疗性功能障碍对比观察150例,经治3个月后,通过采用阴茎肱动脉血压指数、YJZ-204A型阳痿检测仪、阴茎勃起硬度测试环测试。结果中西医结合组总效率89.5%,西医组总有效率61.1%。比较有显著差异(P<0.01);提示兴痿延时汤可提高阴茎的勃起硬度及延长同房时间。     

PC12细胞中氧化还原因子-1对过氧化氢和谷氨酸损伤的不同反应

目的通过研究PC12细胞抗氧化应激的氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor1,APE/Ref-1)分子在过氧化氢和谷氨酸损伤过程中表达水平的变化,探讨谷氨酸对神经细胞损伤的分子机制。方法以PC12细胞作为神经细胞模型,以200和400μmol/L浓度的过氧化氢或以10和20mmol/L谷氨酸钠处理PC12细胞,用噻唑蓝法(MTT法)检测细胞的损伤程度,以Western blot方法测定APE/Ref-1表达水平。结果过氧化氢对PC12细胞的APE/Ref-1蛋白表达具有诱导作用。谷氨酸对PC12细胞的APE/Ref-1蛋白表达无影响。结论谷氨酸对PC12细胞的损伤过程中,所产生的氧化应激作用的水平很低,远不足以引起抗氧化应激的APE/ref-1蛋白的代偿反应。     

感受态细胞的快捷制备和转化

在分子生物学实验技术体系中 ,感受态细胞的制备和转化是基本的实验操作。目前 ,氯化钙法感受态细胞的制备和转化 ,由于相对简便和重复性好 ,得到广泛地应用 ,但该方法还不够快捷。一步法感受态细胞的制备和转化虽然快捷 ,但所用的ＰＥＧ335 0和ＤＭＳＯ远非ＣａＣｌ2 那样廉价易得。基于对感受态细胞的制备和转化原理的理解 ,我们对传统的氯化钙法进行了大胆地改进 ,使感受态细胞的制备和转化更加快捷 ,为实验者节省了宝贵的时间。本文对此进行介绍 ,以利于同行参考和使用。1　材料与方法1 1　感受态细胞的制备用接种环沾取甘油保存的ＤＨ5…     

银杏叶提取物对无心跳供肝热缺血损伤保护作用的实验研究

目的　探讨传统中药银杏叶提取物对肝脏热缺血损伤的保护作用。方法　建立猪肝脏在体完全缺血90min的模型。实验分为3组,对照组11头动物,实验组（银杏组）10头动物,前列腺素E1对照组（PGE1组）9头动物。PGE1组和银杏组按分组要求分别于缺血前30min给予PGE1和银杏叶提取物;观测肝组织中自由基、肝脏能量代谢、肝功能及肝组织病理改变等。结果　PGE1组和银杏组上述指标都优于对照组,银杏叶提取物比PGE1具有更强的抗自由基作用,而在其它方面与PGE1相类似。结论　银杏叶提取物是比PGE1更好的热缺血保护剂,能显著减轻供肝的热缺血损伤。     

肌肽对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

本研究采用过氧化氢和谷氨酸纳作用于PC12细胞,成功的制作了氧化应激损伤的细胞模型。将培养的细胞进行分组：正常对照组;损伤组;分别给予过氧化氢和谷氨酸钠;肌肽保护组,同损伤组的制备,但予先加入肌肽。用MTT法检测了各组细胞的生长状态并测定了LDH活性,观察了细胞形态和蛋白电泳等。结果表明：在保护组,MTT的测定结果高于损伤组,LDH低于损伤组,其细胞生长状态和蛋白质电泳结果也与损伤组有显著差异,证明了肌肽对PC12细胞的氧化应激损伤有明显保护作用。