非传统型肌球蛋白Myo10对结肠癌细胞SW620生长的影响及其机制

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Myo10蛋白敲除稳定细胞系,探讨Myo10对结肠癌细胞SW620形态、增殖和细胞周期的影响。方法:根据sgRNA设计网站选择并合成5对针对人Myo10基因的sgRNA序列,经退火形成双链后,用T4DNA连接酶将其与经BsmBⅠ线性化的Lenti-CRISPR v2慢病毒载体连接,包装成病毒感染SW620细胞。经嘌呤霉素筛选后用Western Blot检测Myo10的表达,选择敲除效率最高的sgRNA序列,进行单克隆细胞筛选,最后再用Western Blot验证Myo10是否敲除。用显微镜、Rhodanmine phalloidin细胞染色观察细胞形态;CCK-8实验及流式细胞术检测细胞增殖及细胞周期变化。结果:经测序鉴定成功构建了5对sgRNA-LentiCRISPR v2慢病毒载体,嘌呤霉素筛选后得到Myo10完全敲除的SW620细胞系。敲除Myo10的SW620细胞形态变圆,其增殖能力明显减弱,细胞周期S期比例增加。结论:成功构建Myo10完全敲除的SW620稳定细胞系;Myo10可影响SW620细胞形态和增殖能力;该实验为后续深入探讨Myo10作为结直肠癌潜在靶向基因的机制研究奠定了基础。     

塞来昔布对Lewis肺癌细胞增殖及移植瘤的抑制作用

目的:探讨选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对Lewis肺癌细胞株增殖及小鼠皮下移植瘤的影响。方法:常规培养Lewis肺癌细胞,实验分为对照组和塞来昔布用药组。MTT法检测细胞增殖水平,损伤修复实验检测细胞迁移能力;将Lewis肺癌细胞接种于12只C57BL/6小鼠皮下,对照组隔日腹腔注射生理盐水;塞来昔布用药组隔日腹腔注射塞来昔布30 mg/kg,24 d后处死,计算抑瘤率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测移植瘤组织中VEGF mRNA表达水平,同时酶联免疫检测小鼠血清中MMP-9浓度。结果:塞来昔布对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖性效应(P<0.05)。20μmol/L塞来昔布组细胞迁移速度(0.37±0.03)μm/h明显减慢,与对照组(3.17±0.22)μm/h相比具有显著性差异(P<0.01);在体实验显示,塞来昔布具有明显的抑制Lewis肺癌移植瘤增殖的作用,同时能抑制移植瘤组织中VEGF表达、降低血清MMP-9浓度。结论:塞来昔布可以显著抑制Lewis肺癌细胞的增殖与迁移能力,且对Lewis肺癌移植瘤有明显抑制作用。     

人端粒酶逆转录酶启动子在裸鼠中增强人喉癌对基因放射治疗的敏感性

目的 探索人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)介导自杀基因辣根过氧化酶(HRP)-吲哚乙酸(IAA)系统联合射线,对相同来源而放射敏感性不同的人喉癌移植瘤模型的治疗作用.方法 建立相同来源而放射敏感性不同的人喉癌(Hep-2和Hep-2R细胞)移植瘤模型,并分为联合治疗组(A组和AR组)、基因治疗组(B组和BR组)、单纯放射组(C组和CR组)和对照组(D组和DR组).瘤内注射脂质体包裹的质粒phTERTp-HRP,腹腔内注射IAA从并联合放疗30 Gy,观察对移植瘤生长的抑制作用.应用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡情况;应用AP法检测瘤内HRP蛋白的表达.结果 裸鼠移植瘤生长以联合治疗组最慢,以对照组最快.A组的肿瘤抑制率为54.8%,B组为10.0%,C组为31.9%,AR组为52.7%,BR组为24.8%,CR组为17.0%.A组和AR组可见大量肿瘤细胞坏死和凋亡,凋亡指数分别为16.6%±1.3%和17.6%±1.3%,高于其他组(P<0.05).B组的HRP蛋白表达率(21.9%±5.7%)低于BR组和(33.3%±8.9%),辐射诱导后,A组和AR组的HRP蛋白表达率分别增加2.1和1.6倍(P<0.05).结论 在不同放射敏感性的喉癌移植瘤模型中,hTERTp能被射线诱导,并根据瘤内端粒酶活性增强HRP基因的表达.hTERTp·HRP-IAA系统通过诱导肿瘤细胞凋亡和引起细胞坏死,抑制裸鼠移植瘤生长,并与射线协同作用,起到放射增敏作用.     

建立人喉鳞癌裸鼠移植模型两种方法的比较

目的:建立人喉鳞癌(Hep-2)裸鼠移植模型,比较两种建模方法成瘤效果。方法:将裸鼠随机分成两组,每组8只,两组分别于皮下接种人喉鳞癌细胞悬液和改良法皮下接种瘤块建立动物模型,观察接种成瘤率、肿块大小、生长速度;免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白表达。结果:接种3d后,改良瘤块接种法组裸鼠可见皮下隆起瘤体,接种1周后,皮下接种瘤细胞法和改良瘤块接种法成瘤率分别为75%、87.5%,比较第1周瘤体体积,P<0.05,但成瘤后肿瘤生长方面无明显的差别(比较第3周瘤体体积,P>0.05),两种方法成瘤后的瘤块hTERT蛋白表达阳性率相同。结论:采用改良瘤块接种法成瘤率高,生长速度快,且裸鼠皮下肿瘤较好的继承了人喉鳞癌细胞的重要生物学特点,该法能较好建立了人喉鳞癌裸鼠移植模型,为后续以端粒酶为靶点的体内抗肿瘤研究奠定良好基础。     

泛素化及其在肿瘤中的作用

泛素化过程是内源性蛋白质降解的主要途径之一,因此参与泛素化过程的泛素交联酶UbE2D3会影响细胞内某些蛋白及核酸的含量、活性进而影响其生物效应。在肿瘤细胞中,这种作用显得尤其关键,可参与部分癌症因子的修饰与降解,从而影响肿瘤的生物学行为。研究表明,在乳腺癌中UbE2D3与人类端粒酶逆转录酶（ hTERT）、放射敏感性、侵袭性等相关。     

细胞分裂周期素25A影响放射线照射后HEp-2细胞的G_2/M期阻滞及凋亡

目的:研究放射线照射后HEp-2细胞的G2/M期阻滞与细胞分裂周期素(CDC)25A表达的相关性及过表达CDC25A蛋白对细胞周期及凋亡的影响。方法:通过流式细胞仪和Western blot方法检测4Gy X线照射后在不同时间点细胞周期及CDC25A蛋白含量;经脂质体转染pEGFP-N1-CDC25A质粒的HEp-2细胞为CDC25A组,转染pEGFP-N1质粒的为空载对照组,通过实时荧光定量PCR法检测这两组细胞中CDC25A的mRNA含量以鉴定转染效率;通过流式细胞仪检测CDC25A组和空载对照组细胞经4Gy放射线照射后细胞周期和细胞凋亡率;通过MTT法检测两组细胞的存活曲线。结果:放射线照射后G2/M期在细胞周期中的比例与CDC25A蛋白含量成正相关;CDC25A组细胞的CDC25A mRNA含量为空载对照组的15倍;过表达CDC25A联合4Gy放射线照射可废除G1/S关卡阻滞,促进G2/M期聚集和提前进入有丝分裂,可导致细胞凋亡增加和细胞存活率降低。结论:CDC25A的含量与G2/M期的比例正相关,调控CDC25A的表达可影响放射线照射后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡水平。     

177例Ⅱ期乳腺癌患者的规范性辅助治疗及影响预后的因素

目的:回顾性研究177例Ⅱ期乳腺癌患者术后辅助治疗是否规范对预后的影响。方法:纳入2000年1月至2005年12月在我院行术后辅助治疗且符合条件的177例乳腺癌患者的临床以及病理资料,探讨患者术后辅助治疗、年龄、绝经状况、淋巴结清扫、TNM分期、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、初发到治疗的时间、术式、病理类型、手术地点等与预后的相关性。结果:本组病例中位随访时间为62个月,随访率为82.49%,其中仅53例患者(29.94%)接受了规范辅助治疗。术后辅助治疗规范组与非规范组的5年总生存率分别为98.11%和93.58%,10年总生存率分别为80.66%和61.57%,两组之间存在统计学差异(P<0.05)。此外,与Ⅱ期乳腺癌患者预后有关的独立因素还包括绝经状况、HER-2状态(P<0.05),而年龄、淋巴结清扫个数、TNM分期、初发到治疗时间、病理类型不能成为影响患者预后的独立因素(P>0.05)。结论:术后规范辅助治疗、绝经状况及HER-2与Ⅱ期乳腺癌患者的预后密切相关。