表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。 目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。 方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。 结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

NT4 TAT 6×His VHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建

目的构建VHL蛋白(von Hippel Lindau protein, pVHL)β结构域肾癌抑制融合肽cDNA,并将其应用于肾癌的微基因治疗。方法分别设计合成pVHLβ结构域104 123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT 6×His cDNA的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得具有NaeI/Eco72I酶识别位点的TAT 6×His cDNA片段和具有Eco72I/BamH I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段,将两个片段分别克隆到pGEM T easy中,使用双脱氧终止法测序,通过DNASIS软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列。用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT 6×His VHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中,构建了pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ质粒。结果经DNA测序证实,获得了编码TAT 6×His cDNA片段和编码VHLβ抑制肽的cDNA片段,分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ酶切图谱证实已将NT4 TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中。结论成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段,构建了具有NT4信号肽的TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA。     

青少年特发性脊柱侧凸症的临床病理研究

对３０例特发性脊柱侧凸症病变组织进行了光镜、电镜及免疫组织化学的观察。结果表明：主弯段躯干凹侧面凹陷区的筋膜肌肉有粘连变性现象。其病理变化特点为感染，肌纤维变性，结缔组织增生，粘连和瘢痕形成。为综合治疗提供了依据。     

Effects of Electro-Acupuncture at Zusanli, Guanyuan for Sepsis Patients and Its Mechanism through Immune Regulation

Objective:To evaluate the effect of electro-acupuncture on Zusanii(ST 36),Guanyuan(RN 4)in patients with sepsis,and explore its mechanism in term of immune regulation.Methods:In this prospective randomized controlled trial,60 patients with sepsis were randomly assigned to the control group and the intervention group equally by block randomization.Patients in the control group received routine treatment and those in the intervention group received electro-acupuncture at bilateral Zusanii and Guanyuan in addition to routine treatment,respectively.The mortality at 28 days,Acute Physiology and Chronic Health Evaluation(APACHE)-Ⅱ score were compared to evaluate the effect,and the levels of T cell subsets(CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+) and monocytes of human leukocyte antigen(HLA)-DR using flow cytometry were compared to explore the mechanism of this combined treatment.Results:Fifty-eight patients completed the trial with29 in each group.There was no significant difference of mortality in the 28 th day between the two groups,with 5 death of 29 patients in the intervention group(17.2%) and 9 of 29 in the control group(31.0%).After treatment,APACHE- II score of both groups was significantly decreased,however,score of the intervention group was lower than the control group(13.28 ±7.07 vs.17.10 ±5.83;P0.01).The levels of CD3+,CD4+,CD8+ and CD4+/CD8+ ratio of the intervention group improved after treatment and were higher than the control group(59.71%±11.94%vs.52.54%± 11.86%;36.46%±7.60%vs.31.58%±10.23%;18.40%±8.82%vs.23.07%±7.30%;2.38±1.14 vs.1.54±0.80,respectively;all P0.05).The expression of HLA-DR significantly increased after treatment in the intervention group than that in the control group(7.28%± 9.26%vs.1.27%±7.00%;P0.01).Conclusion:Electro-acupuncture at Zusanii and Guanyuan could improve clinical curative effect in patients with sepsis,which might be achieved by regulation of the immune system.     

20%小牛血去蛋白提取物促进角膜上皮修复的临床研究

目的:评价20%小牛血去蛋白提取物眼用凝胶在翼状胬肉术后对角膜上皮修复的效果。方法:随机选择2010-09～2011-03沈阳爱尔眼视光医院明确诊断为翼状胬肉的患者39例39只眼,实施翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术。切除胬肉后,沿胬肉头部边缘处,用直径为7.0mm环钻将缺损的角膜上皮区域划出整齐的区域,刮除该范围内残余上皮,在角膜缘处制作统一大小(约15mm2)的角膜上皮缺损区。术后第一天开始,分别应用20%小牛血去蛋白提取物眼用凝胶29例(29只眼)每日4次,和不应用20%小牛血去蛋白提取物眼用凝胶10例(10只眼),分为试验组和对照组。术后随访2～4d,试验组和对照组分别于术后12h、24h、36h、48h、60h、72h及96h测量角膜上皮缺损面积,并荧光素染色,裂隙灯照相记录。结果:患者性别、年龄无明显差异。治疗和对照组结果进行方差分析,试验组角膜上皮缺损面积在观察时间点分别是(10.36±1.28)mm2、(6.54±2.31)mm2、(3.23±1.63)mm2、(1.29±0.45)mm2、0mm2、0mm2和0mm2;对照组角膜上皮缺损面积分别是(11.15±2.63)mm2、(9.43±1.37)mm2、(7.51±1.04)mm2、(5.01±2.35)mm2、(3.62±1.18)mm2、(1.28±0.49)mm2和0mm2;两组比较术后12h及96h无统计学差异(P>0.05),余均存在统计学差异(P<0.01)。结论:20%小牛血去蛋白提取物眼用凝胶在翼状胬肉术后对角膜上皮修复有明显效果,在术后应用12h时候即显示出促进上皮修复作用。     

腺相关病毒介导心肌肌浆网三磷酸腺苷酶基因治疗心力衰竭犬的安全性分析

目的研究心肌注射重组腺相关病毒(rAAV)_(2/1)介导心肌肌浆网Ca~(2+)-ATP酶(SERCA2a)基因治疗慢性心力衰竭犬的安全性。方法选取成年比格犬8只,随机分为对照组和SERCA2a基因转导组(转导组),每组4只。分别采用PCR、RT PCR和Western blot法从DNA、RNA和蛋白水平检测rAAV_(2/1)SERCA2a转导后在犬体内的分布;采用双夹心ELISA法检测转导组犬的血清。结果除注射rAAV_(2/1)的心肌区域外,未注射rAAV_(2/1)的心肌区域、主要脏器、骨骼肌和性腺中均未检测到rAAV_(2/1)-SERCA2a。对照组与转导组犬心肌、腰大肌、咀嚼肌和睾丸表现出相同的SERCA2a蛋白表达谱,未在其他组织中检测到。转导组犬血清内未检测到抗rAAV_(2/1)抗体。结论 rAAV_(2/1)介导的基因转导是相对安全的,未整合到心脏以外的其他组织,也未在犬体内引发体液免疫。     

川芎嗪对脓毒症大鼠心功能保护作用的研究

目的研究川芎嗪注射液对脓毒症大鼠心功能的保护作用。方法 45只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)、川芎嗪组(TMP组),每组15只,分别在造模后12,24,48,72 h用心脏超声检测大鼠的心功能,72 h后留取大鼠左室心肌,进行组织形态学观察。结果与Sham组比较,在12,244,87,2 h 4个时点,CLP组大鼠EF值降低,差异有统计学意义(P<0.05),而TMP组大鼠在上述4个时点可提高EF值水平,与CLP组比较差异有统计学意义(P<0.05);在心肌组织形态学方面,与CLP组比较,TMP组大鼠心肌炎症较CLP组减轻。结论川芎嗪注射液有抑制炎症反应,改善脓毒症大鼠心功能的作用。     

经皮穿刺气管切开术在急救中的应用

经皮穿刺气管切开术（PDT）由于操作简单、安全、并发症少在国内已被广泛应用于急危重症患者的抢救治疗。我院自2004年7月至2010年7月在急救中先后为46例患者实施了PDT,报告如下。     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.