肌浆网钙ATP酶基因转导对慢性心力衰竭犬心肌蛋白质组影响的初步研究

目的 分析心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a,SERCA2a)基因转导对慢性心力衰竭(HF)犬心肌蛋白质组的影响,探讨SERCA2a基因转导改善心功能的机制.方法 快速右心室起搏建立HF犬模型并随机分为HF组、HF+绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent pmtein,EGFP)组、HF+SERCA2a组.后两组分别向心肌内注射携带EGFP和SERCA2a基因的rAAV载体.于基因转导30 d时停止起搏后进行超声心动图和血流动力学检查并制备心室肌双向电泳蛋白样品和心肌双向电泳图谱,图像分析软件分析蛋白表达差异点,MALDI-TOF-MS数据库搜索鉴定蛋白质.结果 基因转导30 d时,HF+SERCA2a组犬的症状、超声心动图和血流动力学指标与HF+EGFP组相比有显著好转(P＜0.05);与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).挑选SERCA2a基因转导后表达量发生明显改变的10个蛋白点进行分析,经质谱鉴定分别为心肌收缩相关蛋白、线粒体能量代谢酶类和应激相关蛋白.结论 以rAAV为载体介导SERCA2a基因转导能够改善HF犬心脏的收缩和舒张功能,其可能的机制是恢复了心肌收缩相关蛋白正常表型或正常表达量,增加了心肌能量的产生,改变了应激相关蛋白的表达.     

心肌肌浆网Ca2+-ATP酶基因转导改善慢性心力衰竭犬心功能的研究

目的： 探讨以重组腺相关病毒(rAAV)为载体的心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因转导对慢性心力衰竭犬心功能的影响。方法: 选取成年比格犬17只，随机分为对照组4只和心力衰竭组11只。快速右心室起搏建立慢性心力衰竭犬模型并随机分为心力衰竭组4只、心力衰竭＋绿色荧光蛋白（EGFP）组4只、心力衰竭＋SERCA2a组5只(其中1只在开胸后死亡)。接受基因导入的心力衰竭犬行开胸术，分别向心肌内注射携带EGFP和SERCA2a基因的rAAV载体。于基因转导30d时停止起搏后进行超声心动图和血流动力学检查。结果: 基因转导30 d时，心力衰竭＋SERCA2a 组犬的症状及超声心动图指标与心力衰竭＋EGFP组相比有显著好转（P<0.05）；与对照组相比无显著差别。血流动力学监测发现，转导SERCA2a的犬LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显升高，平均值较EGFP组分别增加54.12％［(214.72±31.74)mmHg vs (139.32±36.79)mmHg］、146.81％［(6 779.43±217.58)mmHg/s vs (2 746.85±931.23)mmHg/s］和71.52％［(-4 341.42±322.02)mmHg/s vs (-2 531.14±616.15 mmHg/s)］，LVEDP则降低了63.43％［(21.86±6.95)mmHg vs (59.78±6.92)mmHg］，所有参数与对照组相比无显著差异。心力衰竭＋EGFP组犬心肌冰冻切片在激光共聚焦显微镜下可见弥漫绿色荧光。结论: 以rAAV为载体介导SERCA2a基因转导能够改善慢性心力衰竭犬心脏的收缩和舒张功能，是1种有前景的治疗慢性心力衰竭的方法。     

快速右心室起搏心力衰竭犬模型的建立

目的应用改进的快速右心室起搏的方法制备慢性心力衰竭犬模型,分析模型相应的临床和血流动力学及病理变化。方法选择比格犬12只,随机分为起搏组(7只)和对照组(5只),起搏组采用230 ppm的频率快速右心室起搏4周,之后改用180 ppm的频率维持右心室起搏4周。对照组正常喂养不处理,4周后测量相应指标。起搏组起搏前、起搏1、8周后,分别行心脏超声、血流动力学检测,之后处死取心脏做病理切片检查。结果与对照组和同组起搏前比较,起搏组犬起搏4、8周后,出现慢性心力衰竭的相应临床表现;超声心动图示各心腔内径均变大,左心室射血分数明显下降,左心导管示左心室舒张末压力增加,左心室收缩末压力及左心室内压最大上升及下降速率降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论经过改进的快速右心室起搏方法,可以产生相对稳定的慢性心力衰竭犬模型。     

重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究

目的探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果。方法14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)r、AAV2(rAAV2-EGFP组6只,rAAV2-LUC组1只)分别转导入小鼠的心包腔内,使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达,冷光CCD相机体内监测LUC在心肌表达。结果rAAV1-EGFP组绿色荧光出现于心肌组织全层;rAAV2-EGFP组绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞。rAAV1-EGFP组小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP组。rAAV1-LUC组小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC组。结论在小鼠心脏中,rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌不同来源株耐药性及流行特征分析

目的 探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在动物食品、动物临床及人医临床中的分布和流行情况,对其耐药情况进行研究分析,为控制MRSA的感染和临床用药提供理论支持。方法 对采集安徽省不同地区动物食品、动物临床及人医临床的标本进行分离培养。采用法国生物梅里埃公司的Vitek全自动微生物分析系统,对分离菌株进行细菌鉴定和药敏试验;应用聚合酶链反应（PCR）方法检测mecA基因;应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对MRSA进行脉冲电泳,BioNumerics软件进行聚类分析。结果 从安徽省淮北、合肥和马鞍山地区共采集动物性食品450份、动物临床标本90份、人医临床标本150份。共分离MRSA 82株,其中动物性食品MRSA（Food-MRSA）14株、动物临床MRSA（La-MRSA）23株、人医临床MRSA（Hu-MRSA）45株,分离培养率为3.1%、30.0%和25.6%;不同来源的MRSA菌株对万古霉素、达福普丁和利奈唑胺100%敏感;对青霉素和苯唑西林100%耐药;对头孢唑啉、红霉素、克林霉素、四环素、庆大霉素、左氧氟沙星、利福平、甲氧嘧啶和氨苄西林有不同程度的耐药,但不同来源MRSA间无差异。82株不同来源的MASA经PFGE分型可分为49个型别,同源性较低。结论 动物临床标本和人医临床标本的MRSA的分离培养率显著高于动物食品的分离率,不同来源的MRSA在药物敏感性方面差异无统计学意义。PFGE 和聚类分析显示,安徽省不同地区不同来源的MRSA其亲缘关系较远,显示其菌株来源的多克隆特征。     

腺相关病毒介导心肌肌浆网三磷酸腺苷酶基因治疗心力衰竭犬的安全性分析

目的研究心肌注射重组腺相关病毒(rAAV)_(2/1)介导心肌肌浆网Ca~(2+)-ATP酶(SERCA2a)基因治疗慢性心力衰竭犬的安全性。方法选取成年比格犬8只,随机分为对照组和SERCA2a基因转导组(转导组),每组4只。分别采用PCR、RT PCR和Western blot法从DNA、RNA和蛋白水平检测rAAV_(2/1)SERCA2a转导后在犬体内的分布;采用双夹心ELISA法检测转导组犬的血清。结果除注射rAAV_(2/1)的心肌区域外,未注射rAAV_(2/1)的心肌区域、主要脏器、骨骼肌和性腺中均未检测到rAAV_(2/1)-SERCA2a。对照组与转导组犬心肌、腰大肌、咀嚼肌和睾丸表现出相同的SERCA2a蛋白表达谱,未在其他组织中检测到。转导组犬血清内未检测到抗rAAV_(2/1)抗体。结论 rAAV_(2/1)介导的基因转导是相对安全的,未整合到心脏以外的其他组织,也未在犬体内引发体液免疫。     

过表达肌浆网Ca2+-ATP酶对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响

目的研究心肌过表达肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响。方法超声心动图检测SERCA2a基因转导对慢性心力衰竭犬心脏收缩功能的影响,放射免疫法测定血管紧张素Ⅱ与心房利钠肽、内皮素-1、肿瘤坏死因子-α、白介素-6等神经内分泌因子。结果 SERCA2a基因转导后心力衰竭犬的心脏收缩功能得到改善(P<0.05),同时上述神经内分泌因子水平均减低(P<0.05)。结论 SERCA2a过表达能改善心肌收缩功能,阻断神经内分泌系统的恶性循环,可能阻止或逆转心肌重塑。     

慢性心力衰竭犬心肌过表达肌浆网Ca~(2+)-ATP酶的安全性分析

目的研究心肌注射法转导肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因治疗慢性心力衰竭犬的安全性。方法检测SER-CA2a基因转导心力衰竭犬的心肌酶学、心肌组织内cAMP含量、心肌耗氧量、心律失常及系统炎症指标、肝肾功能。结果 SER-CA2a基因转导治疗不增加细胞内cAMP浓度,心律失常的发生率和心肌氧耗未增加,未引起明显的全身炎症反应和肝肾功能的损伤。结论 SERCA2a基因转导是一种安全的治疗策略。     

超声心动图在评估犬慢性心力衰竭模型中的作用

目的探讨超声心动图在评估犬慢性心力衰竭模型中的作用。方法对10只比格犬进行快速右心室起搏,起搏前及起搏4周停止起搏后进行多普勒超声心动图和血流动力学检查。结果快速右心室起搏4周后,所有犬都出现气促、四肢浮肿等情况,并有不同程度的胸、腹腔积液。超声心动图示左室EF、FS较起搏前显著降低（P<0.01）,分别为（0.63±0.05）vs（0.42±0.10）和（0.33±4.50）vs（0.19±6.19）;血流动力学检测示犬左室±dp/dtm ax较起搏前均显著降低（P<0.01）,分别为[（9846±415）vs（3330±307）mmHg/s]和[（-7925±3558）vs（-2260±113）mmHg/s]。起搏前后犬左室EF和FS值与+dp/dtm ax值呈良好的正相关（P<0.01）。结论通过超声心动图和血流动力学指标的相关性分析,表明超声心动图在评价心力衰竭动物模型上是无创、便捷、重复性好的方法。