造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为研究该基因在心肌病发病中的作用提供模型。方法 Western blot检测FAM55A在野生型小鼠与cTnTR141W转基因小鼠心脏组织中的表达变化及其在野生小鼠的组织表达谱。克隆人源FAM55A基因入α-MHC启动子下游构建a-MHC-FAM55A表达载体,显微注射法建立FAM55A转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blot鉴定人源FAM55A在转基因小鼠心脏中的表达,超声检测转基因小鼠心脏的几何构型和功能。HE染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 FAM55A在野生型小鼠心脏中有少量表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达增加。建立了1个心脏组织特异表达人源FAM55A转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,FAM55A转基因小鼠的心脏收缩期和舒张期左室前壁从1月龄到5月龄持续增厚,3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强,1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能则与同龄野生型小鼠相比无变化。组织学检测显示,转基因小鼠心脏左室心肌细胞不均匀肥大,但不发生紊乱。结论 FAM55A在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达上调,建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

RhoC和IQGAP1蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨RhoC和IQGAP1蛋白在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床病理意义.方法:采用免疫组织化学法分别检测56例原发性肝细胞癌和15例正常肝组织中RhoC及IQGAP1蛋白的表达,并分析两者的相关性及与临床病理因素的关系.结果:RhoC和IQGAP1在...     

Transgelin在伴随糖尿病的胰腺癌中的表达及其对SW1990细胞运动侵袭的影响

目的 探讨骨架相关蛋白Transgelin在伴或不伴糖尿病的胰腺癌组织中的表达,及其对胰腺癌SW1990细胞运动侵袭的影响。方法 采用免疫组织化学法检测Transgelin在92例胰腺癌患者（其中伴糖尿病者45例）的癌组织、癌旁组织（距癌边缘＞5 cm）中的表达水平,分析其与临床病理特征的关系;设计并体外合成靶向Transgelin的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果 Transgelin在胰腺癌 组织中的表达阳性率为68.5％(63/92),显著高于癌旁组织[33.7％(31/92),P＜o.05]。伴随糖尿病的胰腺癌组织中Transgelin表达阳性率为84.4％(38/45),显著高于无糖尿病的胰腺癌组[53.2％(25/47),P＜0.05]。胰腺癌组织中Transgelin表达与胰腺癌的淋巴结转移及TNM分期密切相关(P＜0.05),与性别、年龄、发生部位、分化程度、门静脉或神经受侵犯无关(P＞0.05)。Transgelin siRNA干扰后48 h,SW1990细胞迁移能力[穿膜细胞数为(49.2±9.5)个]明显低于阴性对照组和空白组[(61.9±7.5)和(65.3±10.6)个,P值均＜0.05];SW1990细胞的体外侵袭能力[穿膜细胞数为(48.0±8.6)个]也明显低于阴性对照组和空白组[（63.5±11.4）个和(67.5±9.6)个,P值均＜0.05]。结论 Transgelin可能通过促进胰腺癌细胞的运动侵袭能力,参与伴随糖尿病的胰腺癌的转移发生。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

SARS-CoV Spike蛋白来源多肽及其单克隆抗体在SARS-CoV感染过程中的作用

目的 探讨SARS-CoV Spike蛋白来源的B细胞表位多肽及其产生的单克隆抗体在SARS-CoV感染Vero-E6细胞系及h-ACE2ICR转基因小鼠过程中的作用,为SARS-CoV疫苗的筛选奠定初步工作基础.方法 将Vero-E6细胞接种于96孔板上,首先应用两种B细胞表位多肽制备而成的单克隆抗体S471-5034A-10及S604-62511B1进行中和实验,随后在相同的实验中加入相关(S471-503,S604-625)或无关多肽干扰抗体的中和作用,当病毒对照空中70%细胞出现细胞病变时,对活细胞进行中性红染色并计算中和指数以分析抗体的中和水平.应用鉴定有中和保护作用的抗体来源的多肽进行h-ACE2ICR转基因小鼠病毒感染后的治疗实验,进一步确定多肽在SARS-CoV体内感染过程中的保护性作用.结果 两种B细胞表位多肽来源的单克隆抗体均可以在一定程度上中和SARS-CoV对Vero-E6细胞的感染,而且这种中和作用可以被加入的其来源多肽所阻滞,这种阻滞作用的强弱与加入多肽的剂量具有相关性.多肽小鼠体内感染治疗实验表明随着体内注射多肽剂量的增加,受感染小鼠肺组织表现出的急性间质性肺炎程度随之减轻,肺组织内检测的病毒载量也有所下降.结论 目前尚无安全有效的治疗SARS的药物,而疫苗是有效抵抗各种感染的工具之一,表位疫苗是新近发展起来的疫苗形式,安全性好,诱导的免疫针对性强.我们的研究表明,S471-5034A-10及S604-62511B1两种单克隆抗体可以中和SARS-CoV对Vero-E6细胞的感染,同时Spike蛋白来源的S471-503多肽在小鼠的感染治疗实验中也表现出保护性作用,可以作为防治SARS-CoV感染的表位疫苗研制候选肽段.     

七种常见宠物二级抗体的制备和HRP标记

目的 制备兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为宠物血清学检测系统的建立提供工具.方法 利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A 或protein G 亲和层析的方法进一步纯化宠物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗宠物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗宠物的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性.结果 纯化了狗、家猫、豚鼠、金仓鼠、松鼠、花鼠和龙猫7种宠物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗这7种宠物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗7种宠物的二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～15000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性.结论 成功制备了HRP标记的兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,为宠物血清学检测体系的建立提供了工具.     

代谢病相关的遗传工程小鼠模型

糖尿病及肥胖症等代谢性疾病已成为影响人类健康的主要疾病,属于多基因所致的代谢综合征,遗传模式复杂多样,至今仍所知甚少.理想的实验动物模型是我们深入了解代谢病病因、遗传及环境因素的必要工具,并且可以用来研究验证新的治疗药物.近年来,已经获得了大量的遗传工程动物模型,包括转基因、基因敲除模型等遗传工程动物,对于代谢性疾病的研究意义重大.本文主要介绍近年来应用较多的糖尿病及肥胖相关的遗传工程小鼠模型遗传特征及应用.     

心脏特异表达肾素(原)受体转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达(p)RR的转基因小鼠,研究(p)RR在心肌病发病过程中的调节作用.方法 将(p) RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立(p)RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型:Western blot和免疫组化的方法检测(p)RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行(p)RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵(ATP2A2)、钠-钙交换体1(NCX 1)以及肌钙蛋白T(cTnT)在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况.结果 建立了心脏高表达(p)RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的(p)RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达(p)RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径( LVID,systolic)降低9％ (P＜0.05,n=18),收缩期容积( LVESV,systolic)减少了23％ (P ＜0.05,n=18),射血分数EF( ejection fraction)升高14％ (P＜0.01,n=18),短轴缩短率FS( fraction shortening)升高20％ (P ＜0.01,n=18);和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调.结论 在心脏中过表达(p)RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达.提示(p)RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能.     

Trim44敲除导致老年大鼠神经元凋亡和学习记忆能力下降

目的 本文利用Trim44条件敲除大鼠,分析Trim44基因敲除后大鼠行为学异常和脑组织的病理改变,探究Trim44基因在神经系统中的作用机制。方法 采用蛋白印迹法,免疫组化法检测TRIM44在脑组织的表达,利用TUNEL染色观察Trim44敲除大鼠神经元的凋亡,Y迷宫、水迷宫和食物迷宫等行为学测试观察敲除大鼠的行为学改变,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白的表达异常。结果 TRIM44在脑皮质中表达,敲除大鼠大脑组织中Trim44敲除效率可达67%;Trim44敲除导致老年大鼠学习记忆能力下降,神经元凋亡,活性形式的caspase 3、caspase 9蛋白表达增加。结论 Trim44敲除促进神经元凋亡,损害大鼠学习记忆能力。提示了Trim44在神经系统的重要作用,敲除模型也可以用于深入的机制探索。