硫化氢对人胚肺成纤维细胞缺氧后增殖活力及细胞凋亡的影响

目的探讨内源性及外源性硫化氢(H2S)对缺氧诱导下人胚肺成纤维细胞增殖效应及凋亡率的影响。方法以2%O2-93%N2-5%CO2体外培养人胚肺成纤维细胞24h,制备细胞缺氧模型。细胞培养分为6组:①缺氧(N2)组;②N2+600μmol.L-1NaHS组;③N2+1200μmol.L-1NaHS组;④N2+6400μmol.L-1NaHS组;⑤N2+400μmol.L-1L-半胱氨酸(Cys)组;⑥N2+200μmol.L-1S-腺苷甲硫氨酸(SAM)组。各组细胞24h缺氧培养后,采用MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖活力和细胞凋亡率。结果与N2组相比,600和1200μmol.L-1NaHS(H2S供体)可降低缺氧后人胚肺成纤维细胞的增殖活力(P<0.01),但对细胞凋亡率无影响(P>0.05);而6400μmol.L-1NaHS虽然不影响细胞缺氧后的增殖活力(P>0.05),但却增加其凋亡率(P<0.05);胱硫醚-β-合酶(H2S合成酶)底物Cys和激动剂SAM对缺氧后人胚肺成纤维细胞增殖活力无影响(P>0.05);但它们却使缺氧后人胚肺成纤维细胞凋亡率高于N2组(P<0.05)。结论内源性及外源性H2S可降低缺氧诱导的人胚肺成纤维细胞增殖活力、促进细胞凋亡,提示内源性H2S还可能通过肺成纤维细胞,抑制缺氧导致的肺血管结构重建发挥其保护作用。     

PI3K/Akt信号通路在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤的作用

目的探讨硫化氢(H2S)对PC12细胞PI3K/Akt信号通路的影响及该通路在H2S神经保护中的作用。方法Western blot法检测H2S供体硫氢化钠(NaHS)处理PC12细胞诱导Akt磷酸化的水平;CCK-8比色法检测细胞存活率;应用碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结果应用不同浓度NaHS处理PC12细胞30 min,在50～400μmol.L-1浓度范围内,呈浓度依赖性地上调Akt磷酸化的水平,但随着NaHS浓度的增加,磷酸化Akt表达量逐渐下降;Ly294002明显抑制了NaHS对Akt磷酸化水平的上调作用。NaHS预处理可以保护PC12细胞对抗600μmol.L-1CoCl2诱导的损伤,使细胞存活率提高及细胞凋亡率降低。而在预处理前使用PI3K/Akt信号通路抑制剂Ly294002,则明显地减弱了H2S的神经细胞保护作用。结论 H2S可通过激活PI3K/Akt信号通路保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤。     

非NO、非PGI2介导大鼠大脑中动脉舒张反应与硫化氢的关系

目的 研究硫化氢(H2S)与非一氧化氮(NO)、非前列环素(PGI2)介导的大鼠大脑中动脉(MCA)舒张反应的关系.方法 采用离体微血管舒缩功能测定大鼠大脑中动脉舒张功能.结果 在U46619预收缩的大鼠大脑中动脉上,10-7~10-4.5mol·L-1的ACh可显著诱导大鼠大脑中动脉呈浓度依赖性舒张,但血管用NO合酶抑制剂L NAME(3×10- 5 mol·L-1)和PGI2合成抑制剂Indo (1×10- 5 mol·L-1)预处理后,ACh的舒张反应有明显的减弱,最大舒张率由78.2%±4.6%降至56.5%±4.0%,并且剩留舒张反应几乎可被内源性H2S合成酶抑制剂PPG(10-4mol·L-1)完全取消.H2S供体NaHS在10- 5~10-2.5mol·L-1范围内对U46619预收缩的大鼠大脑中动脉也呈一定的浓度依赖性舒张作用.结论 非NO、非PGI2介导的大鼠大脑中动脉舒张反应与H2S有关.     

五种二苯乙烯类化合物对一氧化氮介导的血管舒张反应的影响及构效关系

目的研究5种二苯乙烯类化合物(白藜芦醇,RES;己烯雌酚,DES;二苯乙烯苷,THSG;反式二苯乙烯,TS和二苯乙烯苷水加成产物,SWA)对一氧化氮(NO)介导的舒张血管反应的影响,并探讨其作用与化学结构的关系.方法采用血管张力记录法,观察药物对大鼠主动脉血管环张力的作用,并测定药物对NO含量和对一氧化氮合酶(NOS)活性的影响.结果RES、DES、THSG、TS和SWA(1、3、10、30、100μmol·L-1)能剂量依赖性地舒张苯肾上腺素(10μmol·L-1)诱发的血管收缩反应,其效价强度,依次为THSG＞DES＞RES＞SWA=TS;与二甲亚砜比较,TS和SWA的作用不明显.L-Arg(1μmol·L-1)可增强RES、DES、THSG的舒张血管作用,而亚甲蓝(1μmol·L-1)却可削弱之.另外,RES、DES、THSG(10μmol·L-1)可增加血管总NO含量及NOS活性,其增加NOS活性作用的强度,依次为THSG＞DES＞RES＞SWA＞TS.结论RES、DES、THSG具有剂量依赖性依内皮性舒张血管作用,此作用与增加NO含量及NOS活性有关.它们结构中的乙烯双键对发挥舒张血管作用是必需的,苯环上的羟基的数量及位置决定着其作用强度.     

血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞产生一氧化氮和三磷酸肌醇活性的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞产生一氧化氮(NO)、超氧阴离子(O2-)、三磷酸肌醇(IP3)活性的影响。方法不同浓度的AngⅡ和胰岛素加入体外培养的人脐动脉平滑肌细胞,分别测定细胞培养液中一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,NO、环鸟苷酸(cGMP)和O2-浓度,3H标记肌醇-逐步洗脱法测定IP3活性。结果胰岛素(10、100、1000mU/L)使平滑肌细胞NOS活性升高,NO、cGMP产生增加,对SOD活性和O2-水平无影响,对IP3活性无明显影响;0.1、0.5nmol/LAngⅡ对NOS活性、NO和cGMP产生无明显影响,1nmol/LAngⅡ使NOS活性下降(P<0.05),NO、cGMP产生减少(P<0.05或<0.01),0.1、0.5、1nmol/LAngⅡ使SOD活性下降(P<0.05或<0.01),O2-水平升高(P<0.01),使IP3活性升高(P<0.05);胰岛素10mU/L AngⅡ0.1nmol/L、胰岛素100mU/L AngⅡ0.5nmol/L、胰岛素1000mU/L AngⅡ1nmol/L使NOS活性下降(P<0.01),NO和cGMP产生减少(P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),O2-水平升高(P<0.01),使IP3活性升高(P<0.05);0.1nmol/LAngⅡ 1μmol/L氯沙坦、0.5nmol/LAngⅡ 5μmol/L氯沙坦、1nmol/LAngⅡ 10μmol/L氯沙坦可以改善AngⅡ引起的NOS、SOD活性下降,NO、cGMP产生减少,O2-水平升高,以及AngⅡ引起的IP3活性升高,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素使平滑肌细胞NO产生增加,对IP3活性无影响。高浓度AngⅡ使NO产生减少,O2-水平升高,使IP3,活性升高,可以被氯沙坦阻断,胰岛素和AngⅡ同时存在时平滑肌细胞NO产生减少,O2-水平升高,可以使IP3活性升高。     

胆红素对小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子的影响

目的探讨胆红素对小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子的影响。方法体外培养小鼠小胶质细胞系BV-2,加入不同浓度非结合胆红素刺激,空白对照组非结合胆红素浓度为0μmol/L,实验组分别为50、100、200μmol/L,观察在不同浓度非结合胆红素刺激下NO的产生情况;于胆红素孵育的不同时间点(分别为2、4、8、12 h)收集细胞上清液,利用ELISA法检测细胞培养上清液中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果胆红素含量为0~100μmol/L时,NO生成量呈增加趋势,50、100、200μmol/L胆红素浓度组NO生成量均高于对照组,且100、200μmol/L组高于50μmol/L组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着胆红素刺激作用的延长,IL-6、TNF-α水平均有所增加,孵育4、8、12 h后IL-6、TNF-α水平均高于孵育2 h,且孵育8、12 h的IL-6、TNF-α水平与孵育4 h比较,差异均有统计学意义(P<0.05);孵育8 h后,IL-6、TNF-α水平趋于稳定,且孵育8 h与12 h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胆红素可能通过多条信号传导途径刺激小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子,在这些通路中实施干预可能成为治疗新生儿高胆红素血症的途径之一。     

5/6肾切除对尿毒症心衰大鼠主动脉NO病理生理机制的影响研究

目的探讨5/6肾切除对尿毒症心衰大鼠一氧化氮(NO)病理生理机制的影响。方法将50只雄性SD大鼠随机分为肾切除(NX)组30只和假手术(Sham)组20只。2组常规检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)及24h尿蛋白定量,采用Griess法测定NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性,实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)的基因表达。结果 NX组术后第6、8周血清BUN、肌酐Scr及24h尿蛋白定量均高于Sham组;eNOS活性低于Sham组;eNOSmRNA的表达水平低于Sham组,iNOSmRNA的表达水平高于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。结论主动脉(包括血管内皮细胞)被损伤后,iNOS增加,而eNOS减少,从而使主动脉的舒张度降低而最终导致心衰。对于5/6肾切除大鼠,受损的主动脉NO途径可能是尿毒症诱发心衰的机制之一。     

氯沙坦对两肾一夹型高血压大鼠血管内皮功能的影响

目的　探讨特异性血管紧张素Ⅱ受体 1阻断剂氯沙坦调节高血压血管内皮功能与一氧化氮合酶 (nitricoxidesynthase,NOS)的关系。 方法　采用两肾一夹型高血压大鼠(two kedney ,one cliphypertensiverat)为动物模型 ,术后第 2、 4、 6wk测血压 ,6wk后处死大鼠测血浆中NO2 -/NO3 -的含量 ,取胸主动脉作离体血管环张力实验 ,免疫印迹方法检测主动脉内皮型一氧化氮合酶 (endothelialNOS ,eNOS)及诱生型一氧化氮合酶 (inducibleNOS ,iNOS)的表达。结果　模型组大鼠相对于假手术对照组血压由 (15 83± 1 4 6 )kPa升高到 (2 3 6 7± 2 2 6 )kPa ,血浆中NO2 -/NO3 -的含量增加 (10 0 8μmol·L-1vs 37 7μmol·L-1,P <0 0 1) ,乙酰胆碱引起的最大舒张百分比下降 (73 5 %vs2 5 % ,P <0 0 1) ,主动脉中eNOS的表达降低 ,iNOS的表达增强 ;氯沙坦治疗后 ,血压、血浆中NO2 -/NO3 -的含量分别下降到 (17 5 6± 1 19)kPa、4 9 1μmol·L-1(P均 <0 0 1) ,乙酰胆碱引起的最大舒张百分比增加到 6 4 2 % ,改善主动脉中eNOS及iNOS的异常表达。结论　氯沙坦可改善两肾一夹型高血压大鼠的血管内皮功能 ,这种作用可能是通过NOS/NO途径调节的     

纳他卡林激活内皮细胞ATP敏感性钾通道SUR2B/Kir6.1亚型对eNOS磷酸化的调节作用

目的纳他卡林可选择性激活ATP敏感性钾通道(K ATP)SUR2B/Kir6.1亚型,引起胞内Ca2+浓度升高,一氧化氮合酶(eNOS)活性增强,NO释放增加。eNOS活性与eNOS磷酸化密切相关,研究表明eNOS-Ser1177、eNOSSer635、eNOS-Ser615磷酸化增强eNOS活性,eNOS-Thr495、eNOS-Ser116磷酸化抑制eNOS活性。本文研究纳他卡林激活K ATP对eNOS各磷酸化位点的影响,以此认识纳他卡林增强eNOS活性的作用特点。方法在培养的内皮细胞上给予(1)10-9¹0-5mol·L-1不同浓度的纳他卡林孵育5 min,(2)预孵育0.0110-5mol·L-1不同浓度的纳他卡林孵育5 min,(2)预孵育0.01¹μmol·L-1格列苯脲30 min,给予1μmol·L-1纳他卡林孵育5 min,提取细胞总蛋白,用Western blot法检测eNOS-Ser1177、eNOS-Ser635、eNOS-Ser615、eNOSThr495、eNOS-Ser116磷酸化的变化。结果纳他卡林可浓度依赖性的升高eNOS-Ser1177、eNOS-Ser635的磷酸化及eNOS-Thr495的去磷酸化,而对eNOS-Ser615和eNOS-Ser116磷酸化无影响。此作用可被K ATP特异性阻断剂格列苯脲拮抗。结论纳他卡林通过激活内皮细胞K ATP,调节eNOSSer1177、eNOS-Ser635的磷酸化及eNOS-Thr495的去磷酸化,但不影响eNOS-Ser615和eNOS-Ser116磷酸化,从而增强eNOS活性。     

外源性硫化氢改善人脐静脉内皮细胞早熟性衰老与eNOS表达的关系

目的 拟探讨硫化氢(H2S)延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的关系,为延缓HUVECs衰老提供新的靶点.方法 建立60μmol/L过氧化氢(H2O2)1 h诱导HUVECs衰老模型;通过检测衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-Gal)染色阳性率来研究评估外源性硫氢化钠(NaHS)预处...     

小檗碱对离体阴茎海绵体NO-cGMP信号通路的调控

目的　观察小檗碱(berberine,Ber)对离体的阴茎海绵体平滑肌肌条的舒张效应及其对NO -cGMP通路的调控。方法　采用离体平滑肌张力记录技术观察L- NAME和L -Arg等对Ber舒张离体阴茎海绵体平滑肌肌条的影响;通过逆转录酶链反应技术(RT PCR)检测大鼠阴茎海绵体中eNOS和iNOSmRNA的表达。应过125I放射免疫测定法,测定不同浓度的Ber对离体家兔阴茎海绵体平滑肌组织中cGMP水平的影响。结果　①在离体阴茎海绵体平滑肌标本上,Ber舒张阴茎海绵体平滑肌的EC50为6 20μmol·L-1②当NO合酶抑制剂L NAME( 0 1mmol·L-1 )存在时,Ber的最大舒张效应由100%降低到84% ±3. 4%。当加入L Arginine(1mmol·L-1 )时,可部分对抗L NAME的作用,小檗碱对海绵体的最大舒张效应可恢复到96% ±4 5%。③Ber( 1, 10μmol·L-1 )浓度依赖性地增强ACh引起的舒张效应,ACh的最大效应分别由72% ±3. 6% 升高到81% ±5. 4%或93%±6. 3%。④Ber孵育海绵体组织mRNA1h和3h。用药后eNOSmRNA表达较之对照组增加,Ber孵育1h组eNOS基因mRNA增加了40%, 3h组增加了66% (n=5,P<0. 01)。但是,相同条件下,Ber对iNOS基因mRNA的相对表达无影响。⑤Ber能直接升高cGMP的含量(P<0 .05),EC50为1. 75μmol·L-1。在cGMP激发剂硝普钠(SNP)存在下,Ber能显著提高海绵     

NO在非诺贝特抗血管紧张素Ⅳ所致心肌肥大中的作用

目的研究非诺贝特(fenofibrate,FF)抗血管紧张Ⅳ(angiotensinⅣ,AngⅣ)所致心肌细胞肥大作用及其机制。方法利用乳鼠心肌细胞培养,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子mRNA表达为肥大指标,观察FF对AngⅣ诱导心肌肥大的作用。Real-time PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白水平的表达;比色法和硝酸还原法分别检测一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和一氧化氮(ni-tric oxide,NO)浓度。结果 AngⅣ诱导心肌细胞肥大(P<0.01);FF浓度依赖性地抑制AngⅣ的作用(P<0.01);FF0.3μmol.L-1明显上调AngⅣ导致的过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)以及内皮型NOS mRNA和蛋白表达的降低(P<0.01),同时增加NOS活性和NO浓度(P<0.01)。PPAR-α阻断剂MK886可完全取消FF的上述作用(P<0.05)。L-精氨酸的作用与FF相似(P<0.01),NOS阻断剂NG-硝基-L-精氨酸-甲酯可完全取消其作用(P<0.01)。结论 FF可能通过激活其特异性受体PPAR-α,上调NOS表达,促进NO释放,最终产生抗AngⅣ诱导心肌肥大的作用。     

一氧化氮参与非诺贝特抗高糖高胰岛素诱导的心肌肥大

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxi-some proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)特异性激动剂非诺贝特(fenofibrate,FF)在高糖高胰岛素(high glucose and insulin,HGI)所致心肌细胞肥大中的作用及其与一氧化氮(nitric oxide,NO)途径的关系。方法乳鼠心肌细胞培养,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子mRNA表达为心肌肥大反映指标,观察FF对HGI致肥大作用的影响。利用Real-time PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白水平的表达;比色法和硝酸还原法分别检测细胞培养液中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活性和NO的浓度。结果FF浓度依赖性地抑制HGI诱导的心肌细胞肥大(P<0.01);FF0.3μmol·L-1明显上调HGI导致的PPAR-α以及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA和蛋白表达的降低(P<0.05);并增加HGI降低的NOS活性和NO浓度(P<0.01)。PPAR-α阻断剂MK886可完全取消FF的上述作用(P<0.05)。L-精氨酸的作用与FF相似(P<0.01)。结论FF可能通过激活PPAR-α,从而促进eNOS的表达及NO的释放,产生抗HGI诱导心肌肥大的作用。     

Urocortin舒张自发性高血压大鼠胸主动脉与NO和K~+通道的关系

目的探讨Urocortin(Ucn)对自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉舒缩功能的作用及机制。方法采用体外血管灌流,观察Ucn对SHR胸主动脉的舒张作用,以及左旋硝基精氨酸甲酯(N(ω)n itro-L-argin ine methyl ester,L-NAME)、亚甲蓝(M ethylene B lue,MB)和格列本脲(G lybenc lam ide)对其舒张作用的影响。结果Ucn(1 nmol.L-1~1μmol.L-1)可明显舒张内皮完整和去内皮SHR胸主动脉(P<0.01),此作用具有剂量依赖性;一氧化氮(NO)合成酶抑制剂L-NAME(100μmol.L-1)和鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂MB部分抑制Ucn舒张血管的作用,而且增强去甲肾上腺素(NE)产生的收缩反应。ATP敏感钾通道(KATP)阻断剂格列本脲(10μmol.L-1)可减弱Ucn的舒血管作用。结论Ucn对SHR血管具有内皮依赖性和非内皮依赖性舒张作用,此作用部分是Ucn增加血管内皮细胞NO水平实现的,并且与NO-cGMP通路和KATP通道有关。     

氯通道阻滞剂抑制人肾小球系膜细胞增殖

目的研究氯通道阻滞剂对肾小球系膜细胞增殖的作用。方法细胞计数和3H-TdR参入量测定确定细胞增殖,应用流式细胞术检测细胞周期时相。结果同对照组相比,氯通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸5-nitro-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid,NPPB、尼氟灭酸使人肾小球系膜细胞数和3H-TdR参入量明显减少(P<0·01,n=8),并呈剂量依赖关系,但不增加系膜细胞乳酸脱氢酶释放量(P>0·05,n=8)。NPPB和尼氟灭酸均使细胞周期停滞在G0/G1期(n=3)。结论氯通道阻滞剂NPPB、尼氟灭酸对人肾小球系膜细胞增殖具有抑制作用。     

大气细颗粒物有机成分在体染毒对大鼠胸主动脉血管反应的影响及其与NO/NOS的关系

目的探究大气细颗粒物PM2.5有机成分在体染毒对大鼠胸主动脉血管反应性的影响及其与血管内皮细胞NO/NOS系统的关系。方法 Wistar大鼠随机分为两组:①染毒组:PM2.5染毒溶液1 ml.kg-1.d-1,iv;②对照组:生理盐水1 ml.kg-1.d-1,iv。染毒10 d后,击晕大鼠,主动脉采血,用于检测血清一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。分离主动脉,用于离体主动脉实验和免疫组织化学染色分析,观察主动脉血管反应性和内皮细胞eNOS和iNOS蛋白表达。结果 PM2.5有机成分在体染毒后,可增强大鼠离体胸主动脉对60 mmol·L-1 KCl及苯肾上腺素(PE,10-5 mol·L-1)的收缩效应,减弱其对乙酰胆碱(ACh,10-9～10-5 mol·L-1)的舒张效应,但主动脉对硝普钠(SNP,10-9～10-5 mol·L-1)的舒张效应则不受影响。PM2.5有机成分在体染毒后,大鼠血清NO含量及iNOS活性增加,但eNOS含量则无明显变化;主动脉血管内皮细胞iNOS表达增加,eNOS表达减少。结论 PM2.5有机成分可影响大鼠胸主动脉环血管反应性,NO/NOS系统功能紊乱可能是其机制之一。     

杨梅素对淋巴细胞活化及增殖的影响

目的研究杨梅素(myricetin)对小鼠T细胞活化及增殖的影响,探讨其作为免疫调节药物开发的可能性并提供相关实验依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术,流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+T细胞CD69表达的影响;采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响,采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2mRNA表达的影响。采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响。结果杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达,并能抑制淋巴细胞增殖反应,同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用。结论杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用。     

二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞G_1期的阻滞作用

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌HT-29细胞G1期的阻滞作用及分子机制。方法采用MTT、细胞计数法、流式细胞术和免疫细胞化学方法分析DADS对体外培养的HT-29细胞增殖抑制作用、细胞周期分布及细胞周期相关蛋白表达的影响。结果MTT法显示,60、120μmol.L-1DADS作用HT-29细胞24 h后,生长抑制率分别达23.1%、45.6%。细胞计数法表明,常规培养HT-29细胞群体倍增时间为22.58 h,60μmol.L-1DADS作用HT-29细胞后,其细胞群体倍增时间延长到31.20 h。流式细胞仪分析结果显示,60μmol.L-1DADS阻滞HT-29细胞在G1期,与对照组相比,可使G1期细胞增加约2倍,而120μmol.L-1DADS显著地将细胞阻滞在G2/M期。免疫细胞化学分析表明在G1期阻滞同时有p21W af1蛋白表达上调,Cyc lin E、C-myc蛋白表达下降。结论低剂量DADS对HT-29细胞的抑制增殖作用可能与G1期阻滞有关,DADS对HT-29细胞G1期阻滞的分子机制可能与调节p21W af1、Cyc lin E、C-myc表达相关。     

钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的抑制作用

目的研究钩藤碱(Rhy)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的抑制作用及其可能的作用机制。方法应用胰酶消化法制备新生大鼠原代心肌细胞,培养3d后,随机分为正常对照组、模型组(AngⅡ0.1μmol·L-1)、Rhy1,3和10μmol·L-1组。心肌细胞加入Rhy0,1,3和10μmol·L-1,30min后再加入AngⅡ0.1μmol·L-1作用48h。采用LeicaQwinV3图像分析系统测量心肌细胞的表面积,BCA法测定总蛋白质含量,激光共聚焦显微镜检测心肌细胞[Ca2+]i,比色法测定细胞培养上清液一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性,实时荧光定量PCR检测心房利钠因子(ANF)、心肌细胞钙调神经磷酸酶(CaN)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表达。结果与正常对照组比较,AngⅡ0.1μmol·L-1明显诱导心肌细胞肥大,心肌细胞表面积由每个细胞(167±28)μm2增加至(462±42)μm2(n=6,P<0.01),总蛋白质含量由平均每个细胞(211±10)pg增加至(299±12)pg(n=6,P<0.01),ANFmRNA表达亦增加,由48±4增加至227±9(n=6,P<0.01);心肌细胞[Ca2+]i荧光强度由93±18增加至149±9(n=6,P<0.01),NOS活性和NO含量分别由(0.76±0.03)kU·L-1和(1.36±0.10)μmol·L-1降低至(0.45±0.09)kU·L-1和(0.73±0.04)μmol·L-1(n=6,P<0.01);另外,NOSmRNA表达降低,CaNmRNA和ERK2mRNA表达增加(P<0.01)。与模型组比较,Rhy1,3和10μmol·L-1可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,对表面积的抑制率分别为50%,57%和61%(P<0.05,P<0.01),对蛋白质含量的抑制率分别为7%,10%和23%(P<0.05,P<0.01),对ANFmRNA表达的抑制率为42%,56%和66%(P<0.01);明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞[Ca2+]i增加,抑制率分别为15%,20%和28%(P<0.01);另外,可增加NOS活性,促进NO释放,并显著增加eNOSmRNA表达,降低CaNmRNA和ERK2mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。结论 Rhy可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与促进NO释放、抑制CaNmRNA和ERK2mRNA表达有关。     

CYP4A/20-HETE和eNOS活化有关的调节蛋白间的相互作用

目的研究CYP4A/20-HETE和eNOS活化有关的调节蛋白间的相互作用。方法培养新生牛肺动脉内皮细胞(PAECs),用免疫沉淀(IP)和免疫印迹(WB)对下列4组的CYP4A,eNOS及eNOS调节蛋白进行测定:对照组:PAECs培养皿中加入与20-HETE处理组体积相同的乙醇溶剂,作用10min;20-HETE处理5min组:PAECs培养皿中20-HETE的浓度为1×10-6mol·L-1,作用5min;20-HET处理10min组:PAECs培养皿中20-HETE的浓度为1×10-6mol·L-1,作用10min;VEGF处理10min组:PAECs培养皿中VEGF的浓度为1×10-8mol·L-1,作用10min。结果经20-HETE处理后:肺动脉内皮细胞eNOS蛋白表达增加、phos-pho-eNOS(Ser1177)合成增加;用VEGF进行的上述实验结果与20-HETE相似;20-HETE促使Hsp、蛋白激酶B(Akt)与eNOS结合。结论免疫沉淀和免疫印迹实验结果表明:CYP4A与eNOS在肺动脉内皮细胞相互结合;20-HETE通过促使Hsp、蛋白激酶B(Akt)与eNOS结合,使eNOS(Ser1177)磷酸化,增加NO释放,舒张血管;VEGF和20-HETE的作用相似。