以lipid A为靶点应用生物传感器技术筛选抗炎中药

目的应用生物传感器跟踪检测技术从传统抗炎中药中筛选具有拮抗内毒素作用的中药，并对其进行活性物质含量排序。方法将lipid A包被于生物传感器的非衍生板，建立靶点，测定22种去鞣质后的中药水煎液与lipid A的亲和力；选择具有较高亲和力的药物与定量脂多糖（5ng／mL）于37℃混合孵育30min，再测定其与lipidA的亲和力，以评价药物水提液中活性物质的含量。结果22种中药均具有与lipidA较高的亲和力（大于100RU）；侧柏叶、地骨皮、石榴皮等16种中药中与lipidA特异性结合的活性物质含量较高。结论应用生物传感器技术建立的筛选平台快速而客观，筛选出的16种中药均含有能与lipidA发生特异性结合作用的非鞣质类活性物质。     

赤芍拮抗内毒素活性物质的分离及生物学活性研究

目的 通过生物传感器技术，应用常规分离技术寻找赤芍中的非鞣质类的抗LPS活性成分。方法 以生物传感器技术和薄层色谱技术为指导，建立赤芍抗LPS成分的有效提取方法。再利用高效液相色谱技术（HPLC）从赤芍中定向分离出具有拮抗LPS作用的活性组分。最后对其进行拮抗LPS活性的药理学评价。结果 利用生物传感器技术完成了对不同产地和不同煎煮方法的赤芍拮抗LPS活性的筛选，确定出醇提法的四川的赤芍中拈抗LPS活性成分的含量最高。并从中定向分离出6个具有与Lipid A结合活性的组分。     

应用生物传感器技术筛选拮抗细菌基因组DNA中药的研究

目的:从传统抗炎中药中筛选具有拮抗细菌基因组DNA(Cytidine -phosphate -guanosine DNA,CpG DNA)活性的中药并对其进行活性物质含量的排序。方法:将CpG DNA包被于生物传感器的生物素样品池以建立靶点,测定114种中药水煎液去鞣质后与CpG DNA的亲和力;选择亲和力较高的35种药物与定量CpG DNA (16.5μg.mL-1)于37℃混合孵育30min ,再测定其与CpG DNA的亲和力,以评价药物水提液中活性物质的含量。结果:114种中药中,半枝莲、薄荷、侧柏叶等35种中药与CpGDNA具有较高亲和力( >100RU) ;侧柏叶、地骨皮、大黄等19种中药与CpG DNA特异性结合的活性物质含量较高。结论:应用生物传感器跟踪检测技术筛选具有结合CpG DNA作用的中药具有可行性,筛选出的19种中药均含有非鞣质类能与CpG DNA发生特异性结合作用的活性物质。     

赤芍拮抗内毒素活性的实验研究

目的:提取分离中药赤芍中拮抗内毒素(LPS)的有效成分并进行药理学活性检测。方法:通过生物传感器,结合常规的中药分离技术,分离提取出赤芍拮抗LPS的有效成分,应用鲎实验和ELISA法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果:赤芍中的有效成分与LPS具有较高的结合作用,该结合作用具有较强的中和LPS活性,在体外能够显著抑制由LPS介导小鼠RAW 2 6 4.7细胞释放TNF α。结论:以LPS为靶点,应用生物传感器技术,可快速、有效地提取分离赤芍中具有较强的中和LPS活性的有效成分。     

诃子抗CPG ODN组分的分离及活性评价

目的：从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN作用的活性组分。方法：应用水提、离子色谱技术等方法，从诃子中分离制备具有拮抗CPGODN活性的组分；并应用生物传感器技术，对所得到的组分进行与CPGODN结合活性的筛选；观察其对CPGODN刺激的小鼠RAW264.7细胞释放炎症介质的抑制作用。结果：应用生物传感器技术筛选出与CPGODN结合活性最高的诃子作为研究对象，应用离子色谱技术从诃子中分离出3组分，其中有3个组分均具有一定的与Lipid A的结合活性，以第3组分与Lipid A的结合活性最强；并对CPGODN刺激的小鼠RAW264．7细胞释放TNF-α具有显著的抑制作用；结论：从诃子中分离出的第3组分具有显著的拮抗CPGODN活性。     

黄芩药材中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇的分离与鉴定

目的:分离并鉴定黄芩药材中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇。方法:依托以Lipid A为靶点的抗内毒素(LPS)药物筛选平台,应用大孔吸附树脂、膜和高效液相色谱法对黄芩水提液进行针对Lipid A的逐级分离纯化,对所得目标化合物采用质谱、核磁共振和红外光谱等技术进行结构解析。结果:从黄芩水提液中分离出活性化合物5KL-1B,其与LipidA的特异性结合值为208.6arc seconds,结构鉴定确证5KL-1B为2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇。结论:本试验建立的定向分离模式目的性强、效率高,可用于天然药物中抗LPS活性物质的富集与分离纯化。     

栀子苷拮抗内毒素的实验研究

目的 研究栀子苷的抗内毒素/脂多糖生物学活性。方法 应用生物传感器技术检测栀子苷与LPS活性中心Lipid A的结合活性、动态比浊法鲎试验检测栀子苷(0、2.5、5.0、10.0 mg/L)对LPS(0.1 μg/L)的中和活性、ELISA法检测栀子苷(0、25、50、100 mg/L)对LPS(100 μg/L)刺激RAW264.7细胞释放细胞因子的影响,进而观察栀子苷(0、10、20、40 mg/kg)对致死剂量LPS攻击模型小鼠的保护作用。结果 栀子苷与Lipid A具有结合活性,量效关系明显;栀子苷(2.5、5.0、10.0 mg/L)在体外对LPS(0.1 μg/L)具有显著的直接中和作用(P<0.01);栀子苷在50-100 mg/L浓度水平能够显著抑制LPS(100 μg/L)刺激RAW264.7细胞释放TNF-α(P<0.01);40 mg/kg的栀子苷对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用(P<0.01)。结论 栀子苷可能通过与Lipid A结合中和LPS的活性,抑制LPS介导的细胞活化,减少细胞因子释放,进而保护脓毒症模型小鼠。     

高密度脂蛋白（HDL）拮抗内毒素的实验研究

目的：通过对高密度脂蛋白（HDL）体内外生物学活性实验研究，探讨HDL对内毒素的中和作用。方法：应用勤和生物传感器技术检测HDL与LPS的结合活性，采用ELISA方法检测HDL对LPS攻击小鼠的保护作用等试验来阐明HDL对LPS的中和效果。结果：应用亲和生物传感器亲和力检测，结果发现HDL与lipidA之间具有很高的．木和能力；HDL可以显抑制LPS刺激小鼠RAW264．7细胞释放TNF—α，并成量效关系；在小鼠体内使用剂量为120mg／kg的HDL可以明显保护致死剂量LPS攻击小鼠，保护率达到70％。结论：HDL在体内外与LPS结合，从而抑制了LPS的生物学活性，被认为是一种内毒素清除剂，对防治脓毒症具有临床指导意义，     

以CpG ODN为靶点应用生物传感器技术筛选抗炎中药

目的:筛选具有拮抗CpGODN作用的抗炎中药。方法:将CpGODN包被于生物传感器的生物素化样品池上,测定78种中药水煎液与CpGODN的亲和力;选择具有较高亲和力的中药水煎液,与CpGODN(33μg·ml-1)37℃孵育30min后,再次测定与CpGODN的亲和力。结果:78种中药中,地榆、大黄、藏青果等14种中药含有结合CpGODN的活性成分;鸦胆子、赤芍、地榆等9种中药活性成分含量较高。结论:筛选得到9种活性含量较高的中药,为下一步分离提纯有效成分单体提供了实验依据。     

斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症研究

革兰阴性菌外膜结构成分脂多糖(LPS)即内毒素,是其主要致病因子,具有广泛而复杂的生物学效应,可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱,多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。这些效应主要是通过LPS与细胞表面的受体结合,激活细胞内信号转导系统,促进细胞因子及炎症介质的大量合成与释放,导致机体失控性炎症反应。在现代医学对由内毒素触发全身炎症反应综合征的治疗仍然一筹莫展的今天,不断有中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用,我们先期的研究结果亦证明中医经典复方凉膈散具有良好的抗内毒素炎症活性,从中药寻找抗内毒素治疗措施呈现良好的前景,抗内毒素中药活性筛选成为关注的热点。然而,对于中药或复方来说,由于成分复杂,影响因素众多,限制了细胞筛选体系和分子筛选体系的应用,特别是在以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象时则更加困难。若用哺乳动物模型进行大规模筛选,则费时、费力、费物资,代价难以承受。利用斑马鱼模型来筛选药物已成为发现候选药物的主要技术。近年来,转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown等技术的使用,结合活体成像技术,使斑马鱼成为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理学及在活体内进行高通量药物筛选的良好模式生物。近年在国家自然科学基金资助下,开展了斑马鱼内毒素炎症模型构建及基于该模型的中药抗内毒素炎症活性筛选研究。采用LPS卵黄囊注射诱导成功建立斑马鱼内毒素炎症模型。以LPS诱导的中性粒细胞及巨噬细胞的迁移聚集、斑马鱼死亡率和生存时间可作为评价抗内毒素炎症活性参考指标。利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了凉膈散方提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选,凉膈散方中单味中药提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选及凉膈散方所含活性单体抗内毒素活性筛选。研究证明该模型用于中药抗内毒素活性评价是可行的。鉴于有效成分组方是创新中药研发的新形式、新方法,我们利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了抗内毒素中药有效成分组方的配伍与配比研究,获得优化配方并申请专利保护。利用LPS诱导的马鱼内毒素炎症模型,建立适宜于不同层次(中药单体成分、单味中药及复方不同提取部位或组分)中药形式抗内毒素活性筛选方法,为抗内毒素中药筛选提供一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本和活体筛选新方法,具有良好的应用前景。     

生物传感器技术在筛选赤芍中抗内毒素有效成分的应用研究

目的 :应用生物传感器技术优选赤芍中抗内毒素有效成分的提取方法。方法 :将内毒素包被于生物传感器的疏水样品池中 ,测定赤芍3种方法提取物与内毒素的亲合力及其与内毒素混合孵育后内毒素亲合力的变化。结果 :水浸法提取物与内毒素具有较高的亲合力 ,以1∶40稀释后能够中和78 1 %的内毒素。结论 :赤芍水浸法能够提取到更多的抗内毒素有效成分 ,测定结果与鲎试剂法一致 ;与传统的鲎试剂法比较 ,生物传感器技术具有快速、高效、直观、无干扰等优点。     

生物传感器技术在分离赤芍抗内毒素单体成分中的研究

目的 :利用生物传感技术从赤芍中分离抗内毒素单体成分。方法 :以LipidA包被生物传感器样品池表面 ,建立筛选靶点 ,并以传感器上回收物的紫外扫描结果为参照 ,通过跟踪测定硅胶柱层析、高效液相色谱 (HPLC)流出组分与LipidA的结合能力 ,分离抗内毒素的单体成分 ,并应用鲎试剂法测定单体成分与体外脂多糖 (LPS)的中和作用。结果 :从生物传感器回收到可与LipidA结合的组分 ,其紫外吸收峰分别为194、215、275nm波长。通过HPLC分离出与LipidA具有较高结合活性的单体成分为1 ,2 ,3 ,4 ,6—O—五没食子酰—β—D—葡萄糖 (PGG ) ,浓度为8、4、2μg/ml的PGG分别能够中和0 1EU/mlLPS活性的68 8 %、43 7 %、31 4 %。结论 :利用生物传感器技术 ,以LipidA为靶点分离赤芍抗内毒素单体成分是可行的 ,且具有高效、快速、准确等优点 ,适合于大规模地从中草药中分离抗内毒素的单体成分。     

内毒素致病机理与抗内毒素药物研究概况

本文报告了国内外抗内毒素药物的研究进展。内毒素致病机理研究；药物抗内毒素作用机理及抗内毒素药物设计。分析了多粘菌素B九肽、类脂A结构拮抗剂、抗脂多糖抗体及免疫治疗、抗内毒素多肽以及中药对内毒素的作用。对新药筛选研制和临床内毒素引发疾病治疗有一定意义。     

The screening and isolation of an effective anti-endotoxin monomer from Radix Paeoniae Rubra using affinity biosensor technology

Lipopolysaccharide (LPS) is a known trigger in the pathogenesis of sepsis, lipid A being the toxic component. One of several adjuvant therapeutic approaches for severe sepsis is currently focusing on the neutralization of LPS. In order to obtain the components from traditional Chinese herbs that can neutralize the endotoxin, aqueous extractions were tested using affinity biosensor technology. From amongst 42 herbs, eight were found to possess lipid A-binding abilities. Radix Paeoniae Rubras had the highest lipid A-binding ability; therefore an aqueous extraction from this plant was investigated further. After preparation using standard methods, including silica gel chromatography and HPLC, we obtained 1, 2, 3, 4, 6-beta-d-pentagalloylglucose (PGG), with lipid A-binding ability. It was found that in vitro, PGG directly bound to lipid A, with a Kd of 32 microM, and that it neutralized the endotoxin both in the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay and in a TNF-alpha release experiment, in a dose-dependent manner. In in vivo experiments, PGG was found to protect mice from a lethal challenge by LPS, and significantly decreased the plasma endotoxin level both in endotoxemic mice and rats, the reduction of the endotoxin level in rats being tightly associated with the TNF-alpha level. In conclusion, we demonstrate the effectiveness of affinity biosensor technology in discovering useful agents amongst traditional Chinese herbs and using this approach we found a new anti-endotoxin agent.     

荔枝核中鞣质类型分析及其提取方法研究

目的研究荔枝核鞣质提取工艺,分析提取物中鞣质的类型。方法采用颜色-沉淀反应对荔枝核鞣质进行鉴别;以提取物中鞣质含量为指标,采用水浸泡,70%甲醇、乙醇、丙酮浸泡,70%丙酮加热回流及超声等提取方法提取得浸膏,用干酪素法测鞣质含量。结果不同溶剂提取工艺中,鞣质提取率高低顺序为丙酮加热回流>丙酮超声>丙酮浸泡>甲醇浸泡>乙醇浸泡>水浸泡。结论荔枝核鞣质为缩合鞣质,70%丙酮加热回流提取物中鞣质含量最高,该方法可为提取荔枝核中鞣质的提取方法。     

大籽獐牙菜的抗内毒素作用

目的:研究大籽獐牙菜对内毒素的拮抗作用。方法:通过观察大籽獐牙菜提取物对内毒素攻击小鼠的死亡率的影响及体外抗内毒素作用。结果:大籽獐牙菜提取物能提高内毒素攻击小鼠的生存率,延长平均存活时间。大籽獐牙菜溶液的浓度对抗内毒素作用强度的影响较大,当大籽獐牙菜浓度大于0.062 5g.mL-1(稀释度在1∶16)时对内毒素有明显的破坏作用,但当浓度稀释至0.031 2 g.mL-1(稀释度在1∶32)时,抗内毒素的作用明显减弱或消失。结论:大籽獐牙菜具有很好的抗内毒素作用。     

Lipopolysaccharide-binding and neutralizing activities of surfactin C in experimental models of septic shock

To evaluate the anti-endotoxin activity of surfactin C, we studied its lipopolysaccharide-binding activity in vitro and therapeutic efficacy in experimental models of gram-negative septic shock. The ability of surfactin C to bind LPS from Escherichia coli O111:B4 was determined using a limulus chromogenic assay. Male ICR mice and Sprague-Dawley rats were given intraperitoneal administration of 1x10(9) colony forming units of E. coli ATCC 25922. After bacterial challenge, all animals were randomized to receive intraperitoneally saline, polymyxin B or surfactin C. Surfactin C not only completely bound to the LPS (its median effective concentration being 13.75 microM) but also improved the survival and reduced of the number of inoculated bacteria in the mouse model of septic shock. Surfactin C reduced the plasma endotoxin, tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide levels in response to septic shock in rats.     

Endotoxin neutralizing peptides

Neutralization and sequestration of bacterial lipopolysaccharide which plays a key role in gram-negative sepsis is required to block the progression of sepsis at early stages in addition to destroying bacteria. Many of the host defense peptides which have antimicrobial activity are also able to bind to and neutralize LPS, however, these two activities do not necessarily correlate. Due to its toxicity application of polymyxin B as the prototype of LPS neutralizing peptide is limited to topical applications and extracorporeal removal of endotoxin. Development of novel endotoxin neutralizing peptides without the toxicity of polymyxin B have been based on the natural host defense peptides, fragments of LPS binding proteins and engineered peptides. Neutralization of LPS can be achieved through several different peptide fold motifs, which are reviewed in this article. Endogenous host defense peptides, fragments of endotoxin-binding proteins and synthetic anti-endotoxin peptides fold into alpha-helical, beta-hairpin, extended and compact conformations without regular secondary structure. In animal models many of the peptides have demonstrated good in vitro and in vivo endotoxin neutralizing activity but up to now none of the peptides has been approved for clinical application with an anti-endotoxin indication. Recent developments include preparation of novel types of endotoxin neutralizing compounds such as peptides modified by lipophilic moieties and non-peptidic molecules, particularly lipopolyamines and on the other hand additional medical applications such as extracorporeal endotoxin removal, targeting to inflammation sites or endotoxoid based vaccines.     

梗阻性黄疸治疗前后内毒素、IL-6和IL-8水平的比较

目的观察梗阻性黄疸患者术前抗内毒素治疗对内毒素（endotoxin）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）的影响.方法50例梗阻性黄疸患者分三组,在术前分别给予一般手术治疗（OJ组）,口服胆盐（OJT1组）和静脉注射抗内毒素抗体（OJT2组）观察血浆内毒素（ET）、IL-6及IL-8含量变化.结果三组术前ET、IL-6和IL-8水平差异不显著;OJT1组和OJT2组用药后血浆ET水平均显著下降,明显低于OJ组（P＜0.01）,术后进一步降低;IL-6在术后14d显著降低（P＜0.01）,IL-8在术后7 d降低（P＜0.05）.结论术前应用胆盐和抗内毒素抗体可有效降低梗阻性黄疸患者围手术期血浆ET、IL-6及IL-8水平.