IL-17RA表达对肝细胞癌(HCC)患者的预后意义及其对HCC细胞株生物学特性的影响

 目的 探讨IL-17RA在人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中表达情况及其对肝肿瘤切除患者预后的影响,并评价其对HCC细胞株生物学特性的影响。方法 收集163例HCC组织并制成组织芯片,免疫组化染色法检测肿瘤组织中IL-17RA的表达情况,Kaplan-Meier法和Cox回归模型分析患者总生存期的影响因素。采用siRNA瞬时转染高侵袭性肝癌细胞株MHCC-97H和Huh7以下调IL-17RA的表达,用划痕实验、Transwell侵袭实验检测转染前后MHCC-97H和Huh7细胞株迁移、侵袭能力,用CCK8方法检测转染前后奥沙利铂对MHCC-97H和Huh7细胞株的抑制率。结果 肿瘤直径大于10 cm （HR=1.820,P=0.028）、合并癌栓（HR=2.087,P=0.003）以及IL-17RA高表达（HR=1.579,P=0.042）是影响HCC患者术后总生存期的独立危险因素;siRNA瞬时转染下调HCC细胞株MHCC-97H和Huh7的IL-17RA表达后,肿瘤细胞的迁移、侵袭能力明显下降,奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率显著提高。结论 IL-17RA高表达是影响HCC患者术后生存的独立危险因素,抑制其表达可以降低HCC细胞株的迁移、侵袭能力,提高奥沙利铂对肝癌细胞株的抑制率。     

Total saponin from root of Actinidia Valvata Dunn prevents the metastasis of human hepatocellular carcinoma cells

Objective:To extract the active component from the root of Actinidia valvata Dunn and to investigate the effects on hepatocellular carcinoma(HCC) cells in vitro.Methods:Total saponin was extracted from the root of A.valvata(TSAVD).HCC cells,such as BEL-7402,HepG2,PLC,SMMC-7721,MHCC-97-H, and MHCC-97-L,were treated with TSAVD in 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide(MTT) assay.BEL-7402 and MHCC-97-H cells were also treated respectively with TSAVD at different concentrations for 24 h in wound healing and adhesion assays,and the effects of TSAVD on BEL-7402 and MHCC-97-H cells mobility and adhesion abilities were observed.Meanwhile,the effects of TSAVD on invasion and migration of BEL-7402 and MHCC-97-H cells were also investigated by transwell chamber in invasion and migration assays. Results:TSAVD at 1.5 mg/mL inhibited BEL-7402 cell proliferation with inhibition ratios(IRs) of 61.08%,74.12%, 84.55%at 24,48,and 72 h,respectively.Meanwhile,TSAVD inhibited MHCC-97-H proliferation in a concentrationdependent manner from 1.5 to 0.5 mg/mL,with the IR of 36%at 1.5 mg/mL at 24 h.For SMMC-7721,PLC, and HepG2,the IR was lower than 30%at 1.5 mg/mL at 24 h.In the wound healing assay,mobility abilities of BEL-7402 and MHCC-97-H cells in TSAVD treated groups were significantly weaker than those of the control group.After pretreatment for 24 h with TSAVD,adhesion abilities were reduced in both MHCC-97-H and BEL-7402 cells,with IRs of 48.50%±4.86%and 49.85%±5.25%at 200 |xg/mL.The IRs of MHCC-97-H and BEL-7402 cells in the migration assay were 49.13%±2.91%and 79.37%±0.09%at 200μg/mL In the invasion assay,IRs were 69.78%±4.88%and 82.48%±0.25%at 200μg/mL Conclusions:Of all HCC cells,the highest inhibition by TSAVD was seen for BEL-7402 proliferation.TSAVD could restrain adhesion,invasion,mobility,and migration abilities of BEL-7402 and MHCC-97-H cells in vitro.     

miR-30c减轻肝细胞肝癌的侵袭与转移

目的:观察miR-30c/snail在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达并探讨其在肝癌侵袭中的作用?方法:定量PCR检测肝癌及肝癌细胞系中miR-30c/snail的mRNA表达水平,通过免疫组织化学和Western blot分别检测肝癌及肝癌细胞系中snail的蛋白表达水平,并在肝癌细胞株中转染miR-30c模拟物或抑制物,分析其对肝癌细胞侵袭的作用?结果:与无脉管转移组相比,miR-30c在有脉管转移组的HCC组织中表达明显下调,同时在高转移肝癌细胞株MHCC-97H中也有相似的结果?转染miR-30c模拟物可减少snail的表达,并减少MHCC-97H细胞的侵袭性,然而,转染miR-30c抑制剂则增加snail的蛋白水平,增加HepG2细胞的侵袭力?结论:上调miR-30c的表达通过直接抑制snail,可减弱HCC的侵袭性?一种新的针对miR-30c的治疗策略可能有利于伴侵袭转移的HCC患者?     

凹陷蛋白-1基因在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及其意义

目的 探讨候选抑癌基因凹陷蛋白(Caveolin)-1在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与HCC侵袭、转移的关系.方法 对123例HCC标本以及MHCC-97L和MHCC-97H肝癌细胞株进行实时荧光PCR法、免疫组化法及Western印迹法检测Caveolin-1 mRNA及蛋白表达,分析其表达与肿瘤侵袭、转移性间的关系.结果 Caveolin-1在肝癌组织中较癌旁组织表达明显下调(P<0.05);HCC 中的表达水平与大/小肝癌(≥5 em或<5 cm)、AFP表达水平、有无大血管侵袭、肿瘤单发或多发及pTNM分期5个因素均呈显著负相关(P<0.05),其在MHCC-97H细胞株中的表达显著低于MHCC-97L(P=0.000);Caveolin-1与HBx表达显著负相关(P=0.044).结论 Caveolin-1表达与HCC侵袭转移密切相关,其表达下调,预示HCC的预后不良;有可能存在HBx蛋白下调Caveolin-1表达的机制.     

体外RNA干扰下调ezrin表达对肝癌细胞生长和运动能力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对肝癌生长和运动转移能力的影响。方法选取4株肝癌细胞系(SF/SMMC7721、MHCC97-H、MHCC-1和HepG2)作为研究材料,针对ezrin基因设计小干扰RNA(siRNA)并通过脂质体转染入细胞。分别通过荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹验证siRNA对ezrin在基因和蛋白水平的下调及下调作用随转染时间的变化。根据Western印迹的结果选取ezrin蛋白表达最低的时间点检测干扰后肝癌细胞生物学行为的改变。运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞周期;电子显微镜观察细胞伪足的形态和数量改变;transwell实验检测肝癌细胞运动和转移能力的变化。结果荧光实时定量PCR和Western印迹显示ezrin siRNA对ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用。下调ezrin蛋白可显著减慢4株肝癌细胞的生长速度,处于分裂期的肝癌细胞比例明显下降(SF/SMMC7721:28·07%下降到21·53%;MHCC97-H:24·94%下降到13·92%;MHCC-1:19·30%下降到13·2%;HepG2:7·73%下降到4·24%)。肿瘤细胞的运动侵袭能力下降,细胞伪足变短,且伪足的形成数量显著减少(SF/SMMC7721:20·8个/细胞±3·0个/细胞与13·2个/细胞±2·4个/细胞,P<0·05;MHCC97-H:18·4个/细胞±2·7个/细胞与14·0个/细胞±2·9个/细胞,P<0·01;MHCC-1:22·6个/细胞±3·5个/细胞与13·3个/细胞±1·9个/细胞,P<0·01;HepG2:31·0个/细胞±2·9个/细胞与17·8个/细胞±2·3个/细胞,P<0·01;每株计数5个细胞)。穿过人工基底膜的细胞数量也明显减少(SF/SMMC7721:49·9个±7·7个与31·9±5·2个,P<0·05;MHCC97-H:58·5个±4·2个与33·0个±3·3个,P<0·01;MHCC-1:57·6个±6·1个与28·3个±3·4个,P<0·01;HepG2:37·3个±3·0个与25·3个±2·3个,P<0·01;每株8个视野)。结论ezrin在肝癌生长和侵袭转移过程中发挥重要的作用,有可能成为抑制肝癌复发转移的关键分子。     

MIG7调节肝细胞癌中血管生成拟态的形成及其对肝癌转移潜能的影响

目的探讨肝细胞癌（HCC）中迁移诱导基因7（ MIG7）的表达与血管生成拟态（VM）形成的相关性,以及MIG7的表达与不同肝癌细胞株VM形成能力及转移潜能的关系。方法应用免疫组织化学方法分析配对的40例HCC原发灶及其转移灶标本中MIG7蛋白的表达和VM形成情况;应用三维培养技术培养不同转移潜能的人肝癌细胞株（高转移潜能肝癌细胞MHCC-97H、低转移潜能肝癌细胞MHCC-97L和非转移肝癌细胞Huh-7）及人正常肝细胞L-02,分别检测VM形成情况; 应用RT-PCR技术检测不同转移潜能肝癌细胞中 MIG7 mRNA的水平;应用Western blot技术检测不同转移潜能肝癌细胞株中MIG7蛋白表达水平。结果①40例配对的HCC原发灶和相应转移灶中,MIG7蛋白的表达与VM形成呈正相关（ rs=0.595,PMIG7 mRNA和蛋白表达及VM的形成能力均大于低转移潜能肝癌细胞株MHCC-97L及非转移肝癌细胞株Huh-7。人正常肝细胞L-02未见VM形成。结论MIG7高表达的肝癌组织中VM形成能力强,MIG7通过调节VM的形成影响HCC的侵袭转移,MIG7是抑制HCC侵袭转移的潜在靶点。     

MUC15在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨黏蛋白MUC15 在肝细胞癌中的表达及临床意义,并分析其和患者预后之间的关系。方法应用实时定量
RT-PCR法及Western blot法检测肝细胞系L02、肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721,以及122例肝癌组织、对应癌旁
非肿瘤组织中MUC15的表达情况;并分析MUC15的表达与相关临床参数及患者预后的关系。结果肝细胞系L02中MUC15
表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721（P<0.05）;MUC15在肝癌组织的表达水平显著低于癌旁非肿
瘤组织（P<0.05）,且MUC15 的表达与肿瘤的TNM分期、肝内或淋巴结转移、门静脉癌栓、病理分级等明显相关（P<0.05）;
Kaplan-Meier生存曲线表明MUC15的低表达是肝细胞癌患者预后差的指标。结论MUC15的表达与肝癌患者的临床病理特
征及预后密切相关,很有可能是肝癌患者预后的一个新的预测指标。
     

SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株的表达

目的研究SATB1在不同侵袭潜能的人肝癌细胞株表达状况。方法分别用荧光定量PCR,RT-PCR,Western blotting及免
疫荧光方法,检测人永生化肝细胞株HL-7702及肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3 中SATB1
的表达。结果相对于HL-7702,SATB1 mRNA在其余5 种肝癌细胞株中都有较高程度的表达,其中高侵袭性HCCLM3、
MHCC97H 表达最高,MHCC97L 次之,SMMC-7721、HepG2 最低（P<0.001）;Western blotting 分析HepG2、SMMC-7721、
MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株的蛋白相对表达量分别为0.271±0.002;0.351±0.023;0.621±0.026;0.878±0.026;
1.236±0.006,高侵袭性HCCLM3相当于HepG2的4.6倍（P<0.001）;免疫荧光显示SATB1在5种肝癌细胞株的胞浆和胞核内均
有分布,高侵袭性细胞株HCCLM3、MHCC97H表现强阳性染色。结论SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株中的表达有差异,
与肝癌转移密切相关。     

Inhibition of connective tissue growth factor overexpression decreases growth of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo

Background  We have previously found that connective tissue growth factor (CTGF) is highly expressed in a rat model of liver cancer. Here, we examined expression of CTGF in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells and its effect on cell growth.

Methods  Real-time PCR was used to observe expression of CTGF in human HCC cell lines HepG2, SMMC-7721, MHCC-97H and LO2. siRNA for the CTGF gene was designed, synthesized and cloned into a Plk0.1-GFP-SP6 vector to construct a lentivirus-mediated shRNA/CTGF. CTGF mRNA and protein expression in HepG2 cells treated by CTGF-specific shRNA was evaluated by real-time PCR and Western blotting. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized to evaluate the growth effect, and a colony formation assay was used for observing clonogenic growth. In vivo, tumor cell proliferation was evaluated in a nude mouse model of xenotransplantation. Statistical significance was determined by t test for comparison between two groups, or analysis of variance (ANOVA) for multiple groups.

Results  Immunohistochemical staining of CTGF was seen in 35 of 40 HCC samples (87.5%). CTGF was overexpressed 5-fold in 20 HCC tissues, compared with surrounding non-tumor liver tissue. CTGF mRNA level was 5–8-fold higher in HepG2, SMMC-7721 and MHCC-97H than in LO2 cells. This indicated that the inhibition rate of cell growth was 43% after knockdown of CTGF expression (P <0.05). Soft agar colony formation assay showed that siRNA mediated knockdown of CTGF inhibited colony formation in soft agar of HepG2 cells (P <0.05). The volume of tumors from CTGF-shRNA-expressing cells only accounted for 35% of the tumors from the scrambled control-infected HepG2 cells (P <0.05).

Conclusions  CTGF was overexpressed in human HCC cells and downregulation of CTGF inhibited HCC growth in vitro and in vivo. Knockdown of CTGF may be a potential therapeutic strategy for treatment of HCC.

     

miR-497抑制肝癌细胞的侵袭与转移

目的:检测miR-497/IGF-1R在肝癌中的表达并探讨其在肝癌侵袭与转移中的作用?方法:定量PCR(real-time PCR)检测肝癌及癌旁组织中miR-497的表达,同时检测肝癌细胞系及正常人肝细胞中miR-497/IGF-1R mRNA的表达水平,免疫组织化学及Western blot检测肝癌与肝癌细胞系中IGF-1R蛋白表达,通过过表达或干扰肝癌细胞系中miR-497的表达,分析其对肝癌细胞侵袭与转移的作用?结果:肝癌组织中miR-497表达水平低于癌旁组织?与无脉管转移组相比,有脉管转移组降低更为明显?同时在肝癌细胞系也有相似的结果,高侵袭性肝癌细胞系MHCC-97H中降低最为明显?IGF-1R在肝癌组织及肝癌细胞系中表达增加?过表达miR-497能降低MHCC-97H中IGF-1R的表达,抑制其侵袭和转移;干扰miR-497表达能增加IGF-1R表达,促进SMMC-7721细胞的侵袭和转移?结论:miR-497在肝癌组织中表达降低,过表达miR-497能下调IGF-1R,抑制肝癌的侵袭与转移,miR-497可能为治疗肝细胞肝癌提供新的靶点?     

Ferroportin in the progression and prognosis of hepatocellular carcinoma

Background

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor in men and the seventh in women and understanding the molecular mechanisms of HCC and establishing more effective therapies are critical and urgent issues. Our objective was to study the expression of ferroportin in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue samples and the relationship between ferroportin expression and HCC characteristics.

Methods

Sixty HCC tissues and their corresponding para-cancer liver tissues (PCLT) were obtained from sixty HCC patients who had undergone hepatectomy in the Second Xiangya Hospital of Central South University. Ten normal liver tissue samples were also obtained as a control. Immunohistochemistry (IHC) was performed to analyze the ferroportin expression in HCC, and the relationship between ferroportin expression and HCC clinical pathological characteristics also was analyzed. For the evaluation of IHC results, the comprehensive scoring criteria were met according to the staining intensity and the number of positive staining cells. Western blotting was performed to detect the expression level of ferroportin in HCC cell lines.

Results

Ferroportin expression in HCC tissue was significantly lower compared to PCLT and normal liver tissue (P <0.05). Moreover, ferroportin expression was related to liver cancer cell de-differentiation, the severity degree in TNM staging, Edmondson-Steiner grading, intrahepatic metastasis and portal vein invasion. In addition, high expression of ferroportin was observed in normal human liver cell lines L02 and HL7702, whereas weak positive expression and even negative expression of ferroportin were observed in HCC cell lines FOCUS, MHCC-97H, HepG2 and SMMC-7721. Furthermore, among the four kinds of HCC cell lines, the expression level of ferroportin was the lowest in MHCC-97H cells.

Conclusions

Ferroportin expression level declines along with the progression of liver cancer, suggesting that the reduction of ferroportin may serve as an important marker for poor HCC prognosis and as a new therapeutic target.     

不同转移潜能的肝细胞肝癌细胞中EMS1/cortactin的表达与定位

目的:研究不同转移潜能的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中株中EMS1/cortactin的表达与定位,探讨EMS1/cortactin与HCC细胞生物学行为的相关意义。方法:在不同生物学特性的HCC细胞株[较高转移潜能的MHCC-97H(97H),惰性潜能的SMMC-7721(7721)和HepG2]中采用RT-QPCR、Western Blot和免疫荧光方法检测EMS1基因和cortactin蛋白的表达,在共聚焦显微镜下观察cortactin蛋白在细胞中的定位。结果:97H、7721、HepG2细胞中EMS1 mRNA水平分别为正常肝细胞株L02的23.5倍、15.3倍和10.5倍;cortactin水平分别为L02的3.6倍、2.7倍和2.6倍(均P<0.05)。HCC细胞株中cortactin蛋白表达高于L02。97H细胞中EMS1/cortactin的表达均高于其他两株HCC细胞。各型HCC细胞株中cortactin蛋白聚集在细胞膜下的皮质区。L02细胞中cortactin蛋白弥散分布在胞质中。结论:HCC细胞中EMS1基因和cortactin蛋白高表达在癌细胞膜下的皮质区,与癌转移潜能相关。     

端粒酶逆转录酶线粒体转位促进肝癌细胞干性及耐药的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)线粒体转位对肝癌细胞干性及耐药的影响.方法 采用大剂量顺铂(CDDP)冲击、间歇诱导的方法诱导肝癌细胞HepG2、Huh7耐药,构建耐药细胞株HepG2/CDDP、Huh7/CDDP,CCK-8检测细胞耐药能力;Western blot检测细胞线粒体hTERT表达情况;激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位;流式细胞术检测耐药细胞干性相关蛋白CD133、EpCAM表达情况;克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Western blot检测耐药细胞干性相关因子OCT-4蛋白表达水平变化.结果 与亲本细胞HepG2[耐药指数(7.69±0.86)μg/mL及Huh7 (7.18±0.35) μg/mL]相比,耐药细胞株对CDDP耐药指数明显增加[HepG2 (41.16±0.42) μg/mL,Huh7 (33.48±0.33)μg/mL,P＜0.01],经顺铂(CDDP)诱导耐药细胞线粒体hTERT表达显著升高,线粒体膜电位增强,CD133+细胞比例[HepG2 (1.44±0.41),HepG2/CDDP (23.15±1.55),P＜0.01]及EpCAM+细胞比例[HepG2 (0.85 ±0.10),HepG2/CDDP (3.96 ±0.10),P＜0.01]增加,克隆形成能力增强,干性相关因子OCT4蛋白表达水平增加.结论 经顺铂诱导的肝癌耐药细胞线粒体hTERT转位显著增加,且具有明显的肿瘤干细胞特征.     

构建RNA干扰真核表达载体抑制肝癌细胞IGF1R表达的研究

目的 构建胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)RNA干扰真核表达载体,探讨人肝癌细胞株MHCC-97H在IGF1R基因抑制前后黏附和侵袭能力的变化及相关信号分子的变化。方法 以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体,以IGF1R为靶基因,按GeneBank IGF1R基因核苷酸序列和Tusch1设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中。转化大肠杆菌Stable3,扩增后提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。转染模型细胞（293T）,进行RT-PCR及Western blotting检测,筛选出沉默效果最好的质粒载体。用脂质体转染MHCC-97H肝癌细胞,G418筛选并建立IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞株。检测MHCC-97H细胞株黏附和侵袭能力及FAK蛋白的表达变化。结果 构建的IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA,经酶切和DNA测序证实与设计完全一致;RT-PCR及Western blotting检测发现IGF1R沉默效率达88%。MHCC-97H细胞IGF1R被沉默后黏附和侵袭能力下降,FAK蛋白表达下降。结论 IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA能够降低MHCC-97H细胞黏附和侵袭能力并抑制FAK蛋白的表达。     

构建RNA干扰真核表达载体抑制肝癌细胞IGF1R表达的研究

目的 构建胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)RNA干扰真核表达载体,探讨人肝癌细胞株MHCC-97H在IGF1R基因抑制前后黏附和侵袭能力的变化及相关信号分子的变化.方法 以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体,以IGF1R为靶基因,按GeneBank IGF1R基因核苷酸序列和Tusch1设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中.转化大肠杆菌Stable3,扩增后提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.转染模型细胞(293T),进行RT-PCR及Western blotting检测,筛选出沉默效果最好的质粒载体.用脂质体转染MHCC-97H肝癌细胞,G418筛选并建立IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞株.检测MHCC-97H细胞株黏附和侵袭能力及FAK蛋白的表达变化.结果 构建的IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA,经酶切和DNA测序证实与设计完全一致;RT-PCR及Western blotting检测发现IGF1R沉默效率达88%.MHCC-97H细胞IGF1R被沉默后黏附和侵袭能力下降,FAK蛋白表达下降.结论 IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA能够降低MHCC-97H细胞黏附和侵袭能力并抑制FAK蛋白的表达.     

苦参碱通过调控β-catenin信号通路抑制肝癌细胞干性

目的探讨苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞干性、β-catenin转录活性以及AKT/GSK3β/β-catenin信号 通路的影响。方法应用MTT法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对 人肝癌HepG2 和Huh7 细胞的克隆形成能力,荧光定量PCR分析0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌 HepG2 和Huh7 细胞干性基因CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133 mRNA的表达水平,双荧光素酶报告基因检测 0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌HepG2 和Huh7 细胞内β-catenin 转录活性,Western blotting 检测 0 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内AKT（蛋白激酶B）、GSK-3β和β-catenin及其相应磷酸化 蛋白的表达水平。结果MTT实验结果显示,苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制肝癌HepG2 和Huh7 细胞的增殖,处理24、 48、72 h 对HepG2 细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565、909.1 μg/mL,对Huh7 细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8、 612.8 μg/mL。苦参碱浓度依赖性地抑制肝癌细胞的克隆形成能力,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞的 克隆形成能力（P<0.01,P<0.001）,200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞的克隆形成能力（P<0.05,P<0.01, P<0.001）。苦参碱能够显著肝癌细胞内CD90、EpCAM和CD133 等干细胞标志物mRNA的表达,其中400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P<0.01,P<0.001）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01,P<0.01）mRNA的表 达,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P<0.01,P<0.01）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01, P<0.01）mRNA的表达。同时400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱显著抑制HepG2细胞（P<0.001,P<0.001）和Huh7细胞（P<0.01,P<0.001） 内β-catenin的转录活性。研究结果显示400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著降低HepG2和Huh7细胞内β-catenin和磷酸化 的AKT和GSK-3β蛋白水平,增加β-catenin的磷酸化水平。结论苦参碱可抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成以及 肝癌干性基因CD90、EpCAM和CD133的表达,其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,从而降低β-catenin的转录 活性有关。     

逆转录病毒介导shRNA抑制Mig-7基因对人肝癌细胞血管生成拟态及体外侵袭转移的抑制作用

目的探讨逆转录病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰迁移诱导基因7（Mig-7）对肝细胞癌（HCC）细胞血管生成拟态 （VM）形成及体外侵袭转移能力的影响。方法设计2条Mig-7 mRNA寡核苷酸序列（Mig-7 shRNA-1,Mig-7 shRNA-2）和1条 作为负对照的无关序列（Mig-7 shRNA-N）。构建Mig-7shRNA 逆转录病毒表达载体质粒,并将要接受转染的人肝癌细胞 MHCC-97H分为6组：转染Mig-7 shRNA-1组;转染Mig-7 shRNA-2组;转染Mig-7 shRNA-N组;转染空载质粒组（Vector）;重 组人血管内皮抑素（ES,商品名：恩度）组;MHCC-97H细胞对照组（Control）。半定量PCR、Western blot检测其对Mig-7表达的 影响;三维细胞培养观察其对VM形成的影响;细胞间粘附实验、Transwell侵袭实验及迁移实验观察其对细胞粘附、侵袭及迁移 能力的影响。结果转染后,Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组中Mig-7 mRNA与蛋白的表达、MHCC-97H细胞形成VM 能力、细胞侵袭、迁移能力明显减低（P<0.05）,细胞间粘附能力明显增加（P<0.05）;Mig-7 shRNA-N 组、Vector 组、ES 组中 MHCC-97H细胞Mig-7的表达、VM形成、细胞间粘附、迁移、侵袭能力较MHCC-97H细胞组均无明显变化。结论逆转录病毒 介导的shRNA能够有效下调Mig-7的表达并明显抑制HCC细胞VM形成能力及侵袭转移能力,增加细胞间的粘附作用;ES对 HCC细胞的Mig-7表达、VM形成、侵袭转移及粘附能力无明显影响。     

Musashi1正调控肝细胞癌细胞的生长并促进其增殖

目的 Musashi1（MSI1）属于RNA结合蛋白（RBP）家族,可特异性地结合mRNA并对蛋白质的翻译起激活或抑制作用,但它在肝细胞癌（HCC）中的功能还未被深入探究。本课题主要探讨MSI1在HCC细胞生长及增殖中的作用及机制。方法 构建MSI1过表达或敲除细胞系。采用免疫组化和Western blot技术检测MSI1在HCC组织中的表达。采用MTT、流式等方法探讨过表达或沉默MSI1对HCC细胞增殖、细胞活力及细胞周期分布的影响,同时检测细胞内PCNA、Cyclin D1以及Wnt/β-catenin通路关键分子APC和β-catenin的表达。结果 MSI1在HCC组织中的表达比非肿瘤的癌旁组织高。与对照细胞相比,HepG2细胞过表达MSI1不仅显著促进了其生长（7 d时的MTT值从0.52±0.12大幅增加至1.01±0.14,P<0.01）,且处于G0/G1期的细胞比率也从（58.42±3.18）%降至（40.67±1.22）%,而S期细胞比率则从（28.51±1.93）%增加至（40.06±1.92）%（P<0.01）。与此同时,细胞PCNA和Cyclin D1蛋白的表达明显上调。反之,敲除MSI1使Huh7细胞的生长显著受抑,更多细胞停滞于G0/G1期（G0/G1期细胞比率从（43.83±1.57）%增加至（62.84±1.22）%（P<0.01）,同时细胞PCNA和Cyclin D1的表达则显著下调。MSI1的过表达可以降低Wnt/β-catenin信号通路分子APC但增加β-catenin的表达,反之MSI1的敲低却可以增加细胞内APC而降低β-catenin的表达。结论 MSI1可以通过正调控HCC细胞的生长及细胞周期的进程而加速HCC病程的进展,其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。     

XB130在肝癌组织中的表达及其对细胞侵袭、迁移的影响

  目的  探讨新型接头蛋白XB130在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况及与组织病理之间的关系,并探索其对肝癌细胞侵袭和迁移的影响。  方法  （1）收集染色肝癌病理切片并分析;（2）筛选各肝癌细胞系HCCLM3,HepG2,SMMC-7721,Hep3B,MHCC-97中 XB130的表达情况并抑制XB130基因。采用Western blotting及RT-PCR法检测XB130的表达量;Tranwell观察细胞侵袭能力;细胞划痕观察细胞迁移能力。  结果  90例肝癌临床病理样本中,染色阳性率为44.4%（40例）,在阳性染色标本中强阳性29例,中-弱阳性11例,同时研究发现临床样本中,24例为肝癌复发患者。XB130在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P < 0.05）,肝癌中XB130表达越高,患者复发率较高,且术后生存时间越短（P < 0.05）。抑制XB130基因后其相对表达量、细胞侵袭、迁移能力均下降（P < 0.05）。  结论  XB130有望成为新的肝癌预后标志物,下调肝癌细胞XB130的表达可减弱肝癌细胞侵袭和迁移能力。