Bmi-1基因沉默对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞生长的体外抑制作用

[目的] 探讨体外沉默Bmi-1基因对人视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法] 免疫组织化学和RT-PCR分别检测Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。体外化学合成法合成靶向Bmi-1基因的siRNA双链转染培养的人SO-RB50瘤细胞。荧光定量RT-PCR和western-blot分别检测转染Bmi-1 siRNA后的人SO-RB50瘤细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白水平的变化。MTT法测定Bmi-1基因干扰后SO-RB50瘤细胞增殖情况。流式细胞仪检测Bmi-1 siRNA对人SO-RB50瘤细胞凋亡的影响。[结果] 免疫组化和RT-PCR显示Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。人SO-RB50瘤细胞经Bmi-1沉默处理后,与阴性对照组相比,Bmi-1在mRNA和蛋白水平抑制率分别为（83.9±3.2）%和（82.8±1.1）%。MTT结果显示干扰组细胞在第3天增殖抑制作用最明显,抑制率达（52.5±1.9）%。干扰组人SO-RB50瘤细胞凋亡率为（20.67±1.1）%,阴性组细胞凋亡率为（1.9±0.2）%,两者有统计学差异。[结论] Bmi-1特异性siRNA能显著抑制人SO-RB50瘤细胞 Bmi-1基因的表达,抑制细胞生长,可能通过促进瘤细胞凋亡而起作用,Bmi-1基因可能为RB治疗的新靶点。     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，导入人胶质瘤细胞U251中，研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则，在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列，间以9个核苷酸的茎环序列，两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中，获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin；采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251；分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果；采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后，U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达，并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。     

SiRNA沉默Livin基因促骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的:研究特异性小分子干扰RNA(siRNA)沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因对细胞凋亡的影响?方法:设计针对人源Livin基因的siRNA,转染至对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞株;RT-PCR检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达的变化,Western blot检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin蛋白表达的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染后细胞凋亡的变化?结果:Livin特异性siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后,Livin基因表达较空白对照和阴性对照显著减少(0.195 ± 0.019 vs 0.539 ± 0.031?0.438 ± 0.029)?Western blot检测结果显示Livin蛋白质水平较空白对照和阴性对照显著减少(0.165 ± 0.022 vs 0.632 ± 0.034?0.625 ± 0.035)?流式细胞仪检测见siRNA组骨肉瘤MG-63细胞凋亡率较对照组明显增加?结论:RNA干扰能有效沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达,促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡?     

Livin siRNA重组腺病毒对胶质瘤U251细胞的增殖、凋亡的作用研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)沉默livin的表达,探讨其对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法制备livin siRNA重组腺病毒后感染U251细胞,采用RT-PCR、蛋白质印迹法检测livin基因的干扰效果,用MTT法和流式细胞术检测U251细胞的增殖和凋亡情况。同时观察重组腺病毒对荷瘤小鼠的治疗效应。结果重组腺病毒Ad-livin siRNA能有效抑制U251细胞的livin mRNA和蛋白水平的表达;抑制U251细胞增殖,促进凋亡;在小鼠体内有效抑制U251细胞的生长和提高荷瘤小鼠的平均生存期（P<0.05）。结论用livin siRNA重组腺病毒介导抑制livin基因的表达,可抑制U251细胞增殖,促进凋亡,为胶质瘤的治疗提供了新策略。     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响

目的: 构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构 (shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用. 方法: 在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Western bloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞. 结果:实时荧光定量PCR以及Western blotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞. 结论: 靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达, 并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

靶向PTTG和survivin基因共干扰质粒对U251细胞的沉默效率

的：探讨共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA对U251细胞人垂体瘤转化基因（PTTG）和生存素（survivin）基因表达的影响。方法：U251细胞分为5组,分别为正常细胞对照组、Lipo2000+ 〖JP〗pGenesil-2.1 HK组(HK阴性对照组)、Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG siRNA、Lipo2000+ pGenesil-2.1- survivin siRNA及Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA。应用RT-PCR法、流式细胞术和Western blotting方法检测转染36 h后的各组U251细胞PTTG与survivin基因 mRNA和蛋白表达。结果：3个干扰组的U251细胞中PTTG和survivin基因mRNA和蛋白表达水平均较HK阴性对照组显著降低（P<0.01）,以共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA组降低最明显。结论：共干扰pGenesil1-PTTG-survivin siRNA质粒对U251细胞中PTTG与survivin基因的沉默效应强于单独沉默其中某一基因的干扰质粒。     

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。 方法：合成特异性干扰PTTG 的siRNA片段,并与pGenesil2 载体连接,构建PTTG干扰载体（pGenesil2-PTTG siRNA）。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组（pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3）,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG 的mRNA和蛋白表达水平进行分析。 结果：酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251 细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P<0.01）。 结论：成功构建了能高效率沉默PTTG 的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。     

脑胶质瘤survivin表达及其反义核酸对U251细胞的作用

目的:观察脑胶质瘤患者脑组织生存素(survivin)的表达及其反义寡核苷酸(survivin ASODN)对脑胶质瘤U251细胞生长和凋亡的影响。方法:RT-PCR法检测脑胶质瘤患者脑组织survivin mRNA表达,脂质体介导下,分别以100、300、500 nmol/Lsurvivin ASODN作用于脑胶质瘤U251细胞48 h后,观察细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:脑胶质瘤患者脑组织有survivin mRNA表达,阳性率为76.7%。不同浓度survivin ASODN转染48 h后,细胞生长抑制率分别为(52.24±6.59)%、(36.14±4.01)%和(24.14±5.57)%,凋亡指数分别为(19.46±3.85)%、(38.6±1.85)%和(55.34±3.16)%,与对照组及不同浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.05~P<0.01)。结论:脑胶质瘤患者脑组织有survivin mRNA表达,survivin ASODN以剂量依赖方式抑制脑胶质瘤U251细胞生长,诱导细胞凋亡。     

微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨微小RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。方法:采用Aurora A特异性siRNA对人脑胶质瘤细胞进行转染,使用Western blot和RT-PCR对Aurora A mRNA及蛋白表达情况进行检测,同时使用化疗药物尼莫司汀(ACNU)对转染后人脑胶质瘤细胞进行处理,观察并分析处理前后胶质瘤细胞的增殖和凋亡情况。结果:40 mg/L ACNU处理后各组U251细胞吸光度较0mg/L ACNU处理后各组细胞器吸光度值明显下降(P<0.05),其中以siRNA干扰组细胞吸光度值最低(0.20±0.05),细胞增殖抑制率为75.1%,远高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);转染Aurora A siRNA的U251细胞在经40 mg/LACNU处理72h后,其细胞凋亡率明显高于0mg/L处理组(P<0.05),且siRNA干扰组的U251细胞在培养72h后其凋亡率均明显高于正常对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:采用特异性微小RNA对Aurora A基因的表达进行干扰抑制,可有效阻碍胶质瘤细胞的增殖过程,且可有效提高胶质瘤细胞对于化疗药物的敏感性,有利于增强恶性胶质瘤术后化疗效果,对于改善患者生存质量,延长其生存时间具有十分积极的意义。     

siRNA沉默COX-2基因对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的 利用小分子RNA(small interfering RNA,siRNA)技术体外沉默人胶质瘤细胞COX-2基因表达,探讨其对放射敏感性的影响,以期为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法。 方法 体外培养胶质瘤U251细胞,使用siRNA技术构建U251细胞COX-2基因沉默模型,Western blot检测转染后细胞COX-2蛋白表达情况,筛出最适序列。将实验分为对照组与转染组,分别予以2、4、6、8 Gy四个剂量组予以X线照射,实验重复3次,使用MTT法检测辐射后细胞增殖抑制情况,平板克隆形成实验检测细胞存活分数(SF)并通过单击多靶拟合曲线计算增敏比(SER),流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果 转染组COX-2蛋白表达情况较对照组均下降,其中以siRNA600序列降低最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05),后续实验均以siRNA600序列进行转染。辐射后转染组的细胞增殖抑制率为(84.87±3.50)%、(63.62±0.35)%、(55.05±4.87)%、(36.85±3.00)%,较对照组增殖抑制作用明显增强,并随放射剂量增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组SF低于对照组,且转染组D0为4.110,Dq为1.387,均低于对照组,对照组D0为6.908,Dq为2.772,放射增敏比SER为1.680,差异有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组细胞凋亡率为(3.63±0.45)%、(6.08±0.87)%、(47.97±2.13)%、(59.56±3.07)%均高于对照组,且在6 Gy、8 Gy照射后升高更为明显。 结论 siRNA技术沉默人胶质瘤U251细胞COX-2基因表达可以提高细胞的放射敏感性,增加了放射后细胞的凋亡率及增殖抑制作用,降低了克隆形成率。      

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的  探讨RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响。方法  分别构建3种靶向c-Met基因的短发卡RNA（shRNA）序列,以脂质体转染的方式导入人脑胶质瘤U251细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。采用PCR和Western blot检测c-Met-shRNA转染后U251细胞c-Met的表达情况,以筛选出可有效沉默c-Met基因的shRNA。c-Met基因沉默后,采用MTT法和流式细胞术检测U521细胞增殖情况,采用Transwell法和细胞划痕实验检测U251细胞侵袭和迁移情况,采用裸鼠荷瘤实验研究U251细胞体内成瘤性。结果  成功构建可有效沉默c-Met基因的c-Met-shRNA1。沉默c-Met后,c-Met mRNA以及蛋白的表达均显著下降,差异有统计学意义（P <0.05）;而且可明显抑制U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力。

     

抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

目的 探讨泛素特异性肽酶22（ubiquitin specific peptidase 22,USP22）对胶质瘤细胞顺铂耐药的作用。 方法 采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,转染USP22小干扰RNA沉默胶质瘤顺铂耐药细胞株U251/CP2中USP22的表达,RT-PCR检测细胞USP22 mRNA的表达水平,流式细胞术检测转染USP22-shRNA对细胞凋亡的影响,CCK-8法检测细胞的活力及耐药指数,Western blotting检测USP22的蛋白水平。 结果 成功构建了顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2、USP22基因沉默细胞株U251-shUPS22和U251/CP2-shUSP22。抑制USP22的表达可以明显提高U251/CP2-shUSP22细胞的凋亡率（P < 0.05）,顺铂上调USP22蛋白在U251和U251/CP2细胞中的表达（P < 0.01）。U251-shUPS22、U251/CP2和U251/CP2-shUSP22各组细胞的顺铂半数抑制浓度分别为（0.56±0.07）μg/mL、（73.73±2.74）μg/mL和（51.25±1.09）μg/mL,与对照U251组（1.23±0.13）μg/mL比较差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 抑制USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,且可在一定程度上逆转耐药细胞株的顺铂耐药,提示USP22是胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制之一。     

Effect of Wild-type p53 Gene Transfection on the Growth and Radiotherapeutic Sensitivity of Human Glioma Cells

Ingliomas,p53mutationsareamongthemostfrequentlyobservedgeneticfindings[1].Asatumorsuppressorgene,p53mutationcanleadtouncon trolledcellproliferation[2].Itwasreportedthattransfectionofwild typep53genemayenhancetheradiosensitivityoftumorcellscontainingwild typep53[3].Inthisstudy,wild typep53genewasde liveredintohumangliomacelllineU251byusingliposome mediatedtransfectiontechniquetoob servetheeffectofp53genetreatmentandcom binedtreatmentofp53andirradiationtherapyongliomacell.1MATERIALSANDMET…     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251，体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响；建立人胶质瘤动物模型，瘤内注射Ad5F35-IL24，观察肿瘤生长情况；用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后，IL-24蛋白高表达，U251细胞和组织的生长受到明显抑制，其凋亡率明显升高，Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

格尔德霉素对胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的：研究格尔德霉素（GDM）对肝细胞生长因子（HGF）引起的胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响。方法：选用人恶性胶质瘤细胞系U251 MG和U87 MG,应用HGF作用24 h后,分别加入不同浓度的GDM再处理48 h。MTT法检测细胞增殖及抑制,分组为：正常细胞组、HGF组、GDM组、HGF+GDM组和紫杉醇组,其中HGF为终浓度30 μg•L^-1,GDM为50、250、500与1 000 nmol•L^-1,紫杉醇为60 μg•L^-1;RT-PCR法检测HGF及c-Met基因的表达,分组如上,GDM为1　000 nmol•L^-1。结果：HGF作用U251 MG与U87 MG细胞24 h后,细胞增殖率分别为0.139±0.070与0.242±0.167,而50、250、500与1 000 nmol•L^-1 GDM对U251 MG和U87 MG生长具有抑制作用,抑制率分别为0.029±0.028、0.027±0.017、0.312 ±0.084和0.339±0.047与0.116±0.069、0.222±0.191、0.269±0.056和0.276±0.031;而紫杉醇对U251 MG和U87 MG细胞的抑制率分别为0.075±0.062与0.071±0.044;RT-PCR结果显示,HGF组HGF与c-Met表达较正常组增加（P<0.05）,而HGF+GDM组则较HGF组明显降低（P<0.05）。结论：GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞增殖,并且能从基因水平抑制其表达。     

RNA干扰沉默CDKL1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用RNA干扰(RNAi)在人胶质瘤U251细胞中沉默CDKL1(cyclin-dependent kinaselike 1)基因的表达,探讨其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建针对CDKL1基因的短发卡(shRNA)慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251细胞,采用实时定量聚合酶链反应和Western印迹法验证CDKL1基因的mRNA和蛋白的表达,确定其抑制效率.采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法和应用Annexin V染色流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况,观察沉默CDKL1基因对U251细胞增殖与凋亡表型的影响.结果 CDKL1-shRNA能有效抑制U251细胞中CDKL1基因的mRNA和蛋白的表达.CDKL1基因沉默后U251各时相的光密度值较感染无义序列的细胞均有降低趋势,第5天时差异有统计学意义(P＜0.05).同时,抑制CDKL1的U251细胞凋亡比例从无义小干扰RNA(siRNA)序列对照组的(9.80±0.21)%上升至(19.26±0.33)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用RNAi方法 能有效沉默CDKL1基因的表达,同时显著降低U251细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞凋亡,表明CDKL1基因可能具有影响胶质瘤发生、发展的作用.     

干扰linc00152抑制胶质瘤细胞增殖与侵袭

目的 观察干扰linc00152的人胶质瘤细胞株U251的增殖与侵袭情况.方法 培养胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为观察组和对照组,观察组转染linc00152-shRNA,对照组转染control-shRNA,采用qRT-PCR法检测两组U251细胞中linc00152 mRNA的表达,采用MTT法观察两组细胞增殖能力,侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力.结果 qRT-PCR结果显示,观察组U251细胞中linc00152的mRNA表达量为(0.313±0.020),明显少于对照组的(1.017±0.082),差异有显著统计学意义(P<0.01);MTT结果显示,观察组的U251细胞的OD值为(0.444±0.032),少于对照组的(0.679±0.052),差异具有统计学意义(P<0.05);侵袭实验结果显示,观察组穿过基质胶的U251细胞数量为(66.9±9.1),明显少于对照组的(146±12.2),差异具有显著统计学意义(P<0.01).结论 在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152能抑制细胞的增殖与侵袭.